院内多重耐药鲍曼不动杆菌分子流行病学和耐药性研究

刘丽娟,陈秀美,张 敏,翟 伟,任玉国

(济南市人民医院 检验科,山东 济南271100)

鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii,AB)是重要的条件致病菌,属于非发酵革兰阴性球杆菌,较强的获得性耐药和克隆性传播的能力,致使多重耐药鲍曼不动杆菌(MDRAB)在院内各类重症监护病房广泛流行[1]。虽然其毒力、致病性不强,但其极高的检出率和耐药率,极易引起爆发流行。一旦由条件致病菌转化为致病菌,给临床抗感染治疗带来极大困扰。掌握院区内MDRAB的耐药机制、传播途径及方式对规范应用抗菌药物、预防控制MDRAB的院内爆发流行极为重要。本研究运用多位点序列分型(MultilocusSe-quenceTyping,MLST)和脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)同时对医院临床及环境分离的MDRAB菌株间的进化关系及院内主要流行克隆进行综合分析,为预防控制MDRAB的院内爆发流行提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 菌株来源

收集2020年5月至2021年4月院内临床及环境分离出的非重复MDRAB菌株 34株。PFGE标准菌株为布伦邓禄普沙门菌H9812(山东省CDC提供)。

1.2 细菌鉴定及药物敏感试验

BD Phoenix NMIC-413复合板进行菌种鉴定及药物敏感性试验,执行2020CLSI标准。另外头孢哌酮/舒巴坦敏感性试验执行CLSI中头孢哌酮的标准,替加环素敏感性试验执行FDA的标准(S≤2 mg/L,I=4 mg/L,R≥8 mg/L),多黏菌素执行2020 USCAST的折点(S≤2 mg/L,R≥4 mg/L)。大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853作为质控菌株。

1.3 耐药基因检测

采用煮沸法提取细菌DNA模板,多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法对β-内酰胺酶耐药基因blaKPC、blaNDM-1、blaOXA-23-like、blaOXA-24-like、blaOXA-51-like、blaOXA-58-like、blaOXA-143-like、CTX、TEM、DHA等进行检测,引物参照文献[2-5]。对部分阳性基因PCR产物进行测序,并将测序结果在GenBank网上查询。

1.4 多位点序列分型

选择 Oxford方案对鲍曼不动杆菌7个管家基因gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi和rpoD进行序列扩增并测序。将测序结果提交到网站(http://pubmlst．org/abaumannii)进行在线序列比对,确定其等位基因型及ST型。再用eBURST软件进行菌株亲缘性分析,其中7个位点中有6个及6个以上位点相同即定义为遗传相关克隆[6-7]。

1.5 脉冲场凝胶电泳

将37℃ 24 h血平皿培养的MDRAB配制成浓度为3.0～3.5个麦氏单位的菌悬液。琼脂糖凝胶包被,蛋白酶K裂解消化,ApaI限制性内切酶于37℃酶切,1%琼脂糖凝胶,电压为 6.0 V/cm,电场夹角为 120°,进行19 h电泳。EB染色后成像。用BioNumerics软件对电泳图谱进行数据分析。PFGE结果按照Tenovel等[8]推荐方法判读,图谱完全一致为同一型,1～3个条带不同者为同一型的不同亚型,差异3个条带以上者为另一型。PFGE 条带相差≥7条为不同克隆。

1.6 统计学分析

用WHONET5.6软件对MDRAB菌株资料进行耐药性分析。

2 结果

2.1 科室及标本分布

收集2020年5月至2021年4月非重复MDRAB菌株34株,临床标本25株,环境标本9株。25株临床标本科室分布:重症医学科病房13株,呼吸重症科病房5株,神经外科病房2株,急症科病房2株、关节运动科、脊柱外科病房、新生儿科病房各1株。9株环境MDRAB菌株均来源于重症医学科病房。标本来源:病房环境采样9株、血液8株、痰液7株、灌洗液5株、穿刺液4株、尿液1株。见表1。

表1 MDRAB科室及标本的分布

2.2 抗菌药物敏感试验MIC值

34株MDRAB对头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦、氨苄西林/舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、环丙沙星、庆大霉素、亚胺培南、美罗培南均100%耐药;氨基糖苷类阿米卡星的耐药率为55.9%(19/34)、妥布霉素的耐药率均为82.4%(28/34);复方新诺明的耐药率为88.2%(30/34);没有出现对米诺环素和替加环素耐药的菌株,但中介率分别为41.2%(14/34)和14.7%(5/34);对多黏菌素100%敏感。见表2。

表2 MDRAB抗菌药物的MIC值(μg/mL)

2.3 β-内酰胺类耐药基因及测序结果

34株MDRAB blaOXA23、blaOXA-51及blaOXA64gp基因PCR扩增均为阳性。TEM基因PCR扩增阳性率为85.3%(29/34),未检出blaOXA-24、blaOXA-58、blaOXA-143、blaKPC、blaNDM-1、CTX、DHA等β内酰胺酶基因。blaOXA-51-Like+blaOXA-23-like+blaTEM三联碳青霉烯耐药模式为85.3%。随机抽取阳性基因扩增产物进行测序,结果分别为blaOXA23、blaOXA-51、blaOXA64及TEM。部分产物扩增及测序见图1～3。

注:Marker为DNA标志物;泳道1～34为临床blaOXA23基因阳性菌株

注:Marker为DNA标志物;泳道1～3,9,14为临床blaTEM-1基因阴性菌株;泳道4～8,10～13,15～34为临床blaTEM-1

图3 OXA23基因PCR产物测序图

2.4 MLST分子分型及PFGE同源性分析结果

25株临床MDRAB用MLST和PFGE进行同源性分析,结果得到7个ST序列类型:依次为ST540(10/25)、ST195(5/25)、ST369(3/25)、ST208(2/25)、ST381(2/25)、ST938(2/25)和ST451(1/25);6个克隆群:分别为A群(9/25)、D群(8/25)、C群(4/25)、F群(2/25)、E群(1/25)、G群(1/25)。ST540和ST195是主要流行的序列类型,A群、B群是主要流行的克隆群。9株环境MDRAB MLST和PFGE同源性监测得到2个ST序列类型:ST208(8/9)、ST540(1/9);2个克隆群:B群(8/9)、C群(1/9)。见表1及图4。

图4 34株MDRAB PFGE聚类分析

3 讨论

MDRAB是院内感染的重要病原菌,尤其在重症监护病房。本研究25株临床MDRAB菌株20株来源于重症监护病房,其中重症医学科13株、呼吸重症病房5株,急症科监护病房2株。重症医学科及院内各专业重症监护病房患者大部分伴有严重基础疾病,免疫力差、住院时间长、具有多种抗菌药物应用史,伴有侵入性操作,原定植于呼吸道的MDRAB菌株极易随着侵袭性操作发生位置的迁移,由定植菌转化为致病菌。25株MDRAB菌株主要来源于呼吸道标本(11/25)和血液标本(8/25)。文献显示鲍曼不动杆菌逐渐成为医院获得性血流感染常见病原菌,有报道在中国西部地区鲍曼不动杆菌已经成为医院获得性血流感染第六位常见病原菌[9],这多与重症监护患者接受侵入性操作是相关的[10]。

CRAB最主要的耐药机制是产生能够水解碳青霉烯的OXA型的D类β-内酰胺酶,包括6个家族:OXA-23-like、OXA-24-like、OXA-51-like、OXA-58-like、OXA-143-like和OXA-235-like。OXA-51-like酶是鲍曼不动杆菌本身固有,其他耐药基因均为外界获得的。其中OXA-23型酶最常见,可同时存在于染色体和质粒中,是与CRAB 院内感染暴发相关最常见的耐药基因。本研究34株MDRAB 100%携带blaOXA23、blaOXA-51、blaOXA64基因,TEM-1基因的携带率为85.3%(29/34),未检出blaOXA-24、blaOXA-58、blaOXA-143、blaKPC、blaNDM-1、CTX、DHA等β-内酰胺酶基因。blaOXA23为院内MDRAB菌株携带的最主要的碳青霉烯酶,是导致耐药性传播的主要基因型。blaOXA-51-Like+blaOXA-23+blaTEM-like是院内主要碳青霉烯耐药模式,高达85.3%(29/34)。对临床常用β-内酰胺类及加酶抑制剂药物均表现出了多重耐药的特征,与课题组以往研究一致[11]。没有出现对米诺环素和替加环素耐药的菌株,但中介率分别为41.2%(14/34)和14.7%(5/34),对多黏菌素100%敏感。提示多黏菌素和替加环素已取代碳青霉烯类抗生素成为院内治疗鲍曼不动杆菌的最后一道防线。但是有研究[12]提示,临床分离的对多黏菌素敏感鲍曼不动杆菌,异质性耐药率高达83%,临床应高度重视抗生素的规范化应用。

MLST和PFGE是菌株同源性分析常用的方法,其中PFGE被誉为细菌分子分型技术的“金标准”,在识别和追踪感染暴发或流行中被广泛应用[13-14]。从25株临床MDRAB MLST和PFGE同源性监测结果来看,2020年至2021年院内临床流行的MDRAB序列类型为ST540(10/25)和ST195(5/25),主要的克隆群为A群(9/25)、D群(8/25);2020年和2021年院内MDRAB流行的主要ST序列型及克隆群存在一定的差异。2020年以ST195(5/16)、D克隆群(8/16)为主,2021年以ST540(7/9)、A克隆群(5/9)为主,ST540、A克隆群贯穿2020年至2021年且在多个重症监护病区播散流行。与环境MDRAB的主要ST208(8/9)和克隆群B群(8/9)不一致。25号感染患者监测到的MDRAB为ST540序列 、G1克隆群与其周围环境MDRAB的ST208和B克隆群完全不同。环境中MDRAB检测到的B克隆群2年内均未在临床MDRAB菌株内流行过。与相关研究重症监护室中鲍曼不动杆菌的感染暴发与其环境传播密切相关[15]不一致。这可能和临床及环境MDRAB标本的采样时间段及标本量的代表性存在一定关系。需要在今后的研究中进一步证实。

综上所述,院内MDRAB主要来源于重症监护病房,blaOXA-51-Like+blaOXA-23+blaTEM-like是院内主要碳青霉烯耐药模式。院内临床流行的主要序列类型为ST540和ST195,主要的克隆群为A群、D群。ST540、A克隆群MDRAB贯穿整个研究阶段且在多个重症监护病区播散流行。临床与环境MDRAB主要流行的ST序列型和克隆群不一致。下一步研究需要进一步规范对临床及环境样本采集量、方式及时间点,对菌株进行同源性分析,识别和追踪感染暴发或流行的根源,从而预防和控制MDRAB的进一步传播。