骨髓染色体联合FISH技术在恶性血液病诊断中的应用价值

李付广,张晓静,谢小雷,汤素环,唐 江,吴爱娟,尹卫国

(1.清远市人民医院 分子诊断中心·广州医科大学附属第六医院,广东 清远511518;2.清远市人民医院 药学部·广州医科大学附属第六医院,广东 清远511518)

细胞遗传学和分子生物学在恶性血液病的发生、发展、诊断以及分型治疗中发挥着重要作用,是对传统的血液学检查和骨髓涂片形态学检查的重要补充[1]。随着世卫组织(WHO)对造血及淋巴组织肿瘤诊断分型标准的不断修订完善,染色体核型在恶性血液病诊断分型中的作用日益突出,已成为细胞形态学(Morphology,M)、免疫学(Immunology,I)、细胞遗传学(Cytogenetics,C)和分子生物学(Molecular biology,M)分型(简称MICM分型)重要的组成部分[2]。然而,由于骨髓染色体标本制备复杂,易受多种因素的影响,如何稳定获得形态良好、长度适宜、分散较好以及数目较多的中期骨髓染色体分裂相仍是细胞遗传学研究中的一个难题[3]。各实验室应根据自身实验条件对影响骨髓染色体制备的影响因素进行优化,以达到最佳制备效果。本研究通过对骨髓细胞接种培养、收获、显带方法等可能影响骨髓染色体制备的每一个环节进行了合理改良和优化,进一步提高了骨髓染色体的制备成功率,改良方法在恶性血液病诊断中尤其在慢性粒细胞白血病(CML)的临床应用中具有重要价值,现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2019年1月至2022年6月来清远市人民医院就诊的355例恶性血液病患者骨髓标本(男性182例,女性173例),平均年龄58.8±14.5岁,中位年龄为60岁。结合临床、MICM分型及张之南等[4]主编的《血液病诊断及疗效标准》对患者进行诊断分型,包括99例急性髓系白血病(AML)患者,16例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者,33例CML患者,13例慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者,82例多发骨髓瘤(MM)患者,53例骨髓增生异常综合征(MDS)患者,27例非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者,25例慢性骨髓增殖性疾病(CMPD)患者,7例慢性粒单细胞白血病(CMML)患者。本研究经清远市人民医院伦理委员会批准,患者均已签署知情同意书。抽取患者2～5 mL骨髓标本注射到专用肝素钠抗凝管,2 h内送检,无溶血、无凝血、未经过高温和冷冻且无污染样本为合格标本。

1.2 实验方法

1.2.1改良骨髓染色体G显带 本研究首先抽取16例恶性血液病患者骨髓,根据文献报道[3,5-7]和临床实践经验,在短期培养法的基础上进行改良,分别对接种浓度、秋水仙碱浓度和作用时间、低渗、培养时间等因素进行优化改良。接种浓度方面,将每例患者的骨髓标本先经有核细胞计数,然后按照2.0×106/mL细胞密度接种;秋水仙碱方面,鉴于骨髓染色体对秋水仙碱较为敏感,将秋水仙碱使用液的浓度由10 μg/mL降为5 μg/mL,在终浓度为0.1 μg/mL条件下作用1 h;低渗液方面,将0.075 M KCl的低渗液改为0.075 M KCl与0.1%柠檬酸钠溶液按3∶1新鲜混合的低渗液,作用30 min,进而增加染色体分散度;保持上述条件不变的情况下,对骨髓细胞的培养时间进行单因素分析,将每份标本接种4瓶,根据培养时间不同分成A、B、C、D四组,培养时间依次为16 、20 、24和28 h,其余步骤同常规染色体方法。条件优化后,所有标本均按改良后的骨髓染色体G显带制备方法进行。

1.2.2镜检与核型分析 采用德国蔡司全自动染色体扫描分析仪对骨髓染色体进行镜检分析,每例标本显带后计数20个核型分裂相,分析5个染色体核型,根据《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN)2016》描述染色体核型,如果可分析染色体分裂相数目不足时,则分析全部染色体分裂相,出现2个以上相同染色体结构异常或数目增加异常,或是3个染色体减少异常,则判为染色体异常,每例标本有5个及以上可供分析的染色体分裂相即视为成功[5]。

1.2.3荧光原位杂交(FISH)检测 为进一步提高CML患者诊断率,对初步诊断为CML的患者同时使用FISH检测试剂盒进行融合基因BCR-ABL检测,实验方法均严格按照试剂盒说明书操作进行,绿色荧光标记为BCR(22q11.2)探针,红色荧光标记为ABL(9q34)探针,BCR/ABL1融合基因显示黄色或红绿叠加信号(F),正常信号模式为2G2R(G为绿色信号,R为红色信号),荧光显微镜下观察200个间期细胞荧光杂交信号,根据《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN)2016》对结果进行描述。

1.3 统计学分析

使用IBM SPSS Statistics 25统计学软件处理实验数据,多组实验结果染色体分裂相均值分析采用单因素ANOVA检验,染色体分裂相组间两两比较采用t检验,骨髓细胞培养成功率多组比较采用卡方检验,Fisher确切概率法分析,P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 单因素实验结果

改良前染色体形态欠佳、分辨率低、分散性差;改良后染色体形态、分辨率、分散性均明显改善,可分析染色体分裂相增多(见图1和图2);单因素分析发现染色体分裂相均值差异有统计学意义(P<0.05),进一步两两对比发现,染色体分裂相值B组高于D组,差异有统计学意义(P<0.05),其他组间染色体分裂相值两两比较差异无统计学意义(P>0.05);培养成功率方面四组之间差异有统计学意义(P<0.05),进一步两两对比分析,B组的培养成功率显著高于D组,差异有统计学意义(P<0.05),其他组间培养成功率两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1和表2。

表1 染色体分裂相数分析实验结果

表2 染色体培养成功率分析实验结果

图1 改良前染色体核型图

2.2 骨髓异常染色体检出结果

采用改良后骨髓染色体制备方法的355例恶性血液病患者中,除12例患者不足5个染色体分裂相外,其余均一性培养成功,成功率为96.6%(343/355),异常染色体检出率为40.3%(143/355),其中CML异常核型检出率最高为93.9%(31/33),AML为41.4%(41/99),ALL为50%(8/16),CLL为15.4%(2/13),MM为19.5%(16/82)、MDS为64.2%(34/53),NHL为14.8%(4/27),CMPD为16.0%(4/25),CMML为42.9%(3/7)。染色体数目以+8、超二倍体(>48条)、亚二倍体(<44条)以及染色体多发异常为主,结构异常以t(9;22)、t(15;17)、t(8;21)为主,t(15;16)、t(7;18)、t(11;22)、I(17)(q10)等比较少见。不同疾病类型异常染色体分布不同,AML以t(15;17)和t(8;21)等特征性结构异常为主;CML以t(9;22)为主,ALL有3例t(9;22),2例+8异常,其余为多发异常;MM和MDS均以染色体多发异常为主,不同类型血液病异常染色体检出率见表3。

表3 异常染色体检出统计

2.3 CML检出结果

33例CML患者经FISH分析,检出BCR-ABL融合基因阳性31例,染色体核型分析检出Ph染色体t(9;22)阳性31例,两者检出率一致,检出率均为94.3%。从CML病程上来看,25例慢性期患者中Ph染色体阳性23例,加速期和急变期Ph染色体阳性检出率均为100%,出现额外染色体3例,分别为+8、+11、+mar。另有1例隐匿型易位t(5;22)(q35;q11.2),1例复杂隐匿型易位51,XXYY,t(1;9;22)(q25;q34;q11.2),+der(9)t(1;9;22),+11,+der(22) t(1;9;22),见表4。

表4 不同病程CML异常核型检出结果

其中1例患者诊断为CML 5年,双下肢疼痛、乏力3个月,双肾囊肿、脾大,外周血白细胞升高(44.5×109/L),轻度贫血(HGB 96 g/L),骨髓涂片和流式细胞学均提示CML急髓变,其中骨髓涂片原始细胞占45%,骨髓活检提示CML急髓变(MF-3级),FISH检测BCR-ABL融合基因阳性nuc ish(ABL1×5,BCR×4)(ABL1 con BCR×2)[92/200],骨髓染色体核型结果为51,XXYY,t(1;9;22)(q25;q34;q11.2),+der(9)t(1;9;22),+11,+der(22) t(1;9;22),为复杂隐匿型易位合并额外染色体异常(图3:BCR-ABL融合基因检测结果;图4:染色体核型分析图)。

图3 FISH检测结果[nuc ish(ABL1×5,BCR×4)(ABL1 con BCR×2)[92/200],注.绿色(G)为BCR(22q11.2)探针,红色(R)为ABL(9q34)探针,黄色或红绿叠加(F)为BCR/ABL1融合基因]

3 讨论

骨髓染色体核型分析对恶性血液系统疾病的诊断分型、治疗、预后判断及发病机制的探讨具有重要意义,目前骨髓染色体的制备方法主要有直接法、即刻低渗法、短期培养法和同步化法,每一方法各有优缺点,实践表明短期培养法相对稳定、染色体分裂相多,比较适合在临床中推广应用[6]。然而骨髓染色体制备影响因素众多,不可避免因细胞培养和染色体制备出现失败。但不同实验室在染色体制备时较难保持完全一致,且不同细胞类型疾病对制备条件也存在差异,因此在制备过程中各实验室应根据自身实验条件进行优化,以达到最佳制备效果,从而提高恶性血液病异常染色体核型的检出率。

3.1 改良骨髓染色体制备方法分析

短期培养影响因素较多,本研究从接种浓度、秋水仙碱浓度和作用时间、低渗液和低渗时间等方面进行优化改良,发现接种浓度在2.0×106/mL,秋水仙碱浓度为0.1 μg/mL作用1 h,0.075 M的KCl与0.1%的柠檬酸钠3∶1新鲜配制的低渗液在37 ℃条件下作用30 min,此时制备的骨髓染色体效果较为理想。研究表明,骨髓染色体制备与培养时间具有相关性,短期培养法时间为24～48 h,因此本研究对培养时间进行了单因素分析。按培养时间分为四组,依次为16、20、24和28 h。发现染色体培养成功率和染色体分裂相数随着培养时间延长呈先升后降趋势,其中B组在染色体分裂相均值、成功率方面最优,与D组相比差异有统计学意义(P=0.041,P=0.037),与A组或C组相比存在差异,但差异性不显著,说明骨髓染色体培养在16～24 h之间为宜,20 h最为理想,不宜超过28 h,本实验结果与文献报道相一致[6-7]。本研究中采用改良后的骨髓染色体制备方法的355例恶性血液病患者,除12例不足5个染色体分裂相外,其余均一性培养成功,成功率高达96.6%(343/355),异常染色体核检出率40.3%(143/355),很好的满足了临床对恶性血液病诊断分型的需求。

3.2 骨髓异常染色体检出结果分析

恶性血液病是发生在骨髓中以造血干细胞异常为主的克隆性恶性疾病,其中大多数恶性血液病患者还伴随着染色体的改变,染色体改变是影响白血病预后的独立因素,染色体异常的类型直接关系着白血病患者的预后情况[8]。本研究发现,355例恶性血液病患者异常染色体检出率为40.3%,与马娟等[9]报道恶性血液病异常染色体检出率42.5%基本一致,其中CML、MDS、ALL、CMML和AML检出率较高,分别为93.9%、64.2%、50%、42.9%和41.4%,而MM、CMPD、CLL和NHL检出率较低,分别为19.5%、16.0%、15.4%和14.8%,异常染色体跟不同类型血液病明显相关,且具有一定的特异性。

研究表明,ALL出现t(9;22)比例高达20%～30%,常预后不良[10],本研究中的16例ALL患者中有7例出现异常染色体,其中t(9;22)检出率为18.8%,与文献报道的成人ALL出现t(9;22)约20%～30%接近[11]。AML异质性较高,伴重现性细胞遗传学异常约30%～40%,且为多发异常[12],本实验AML异常染色体检出率为41.4%(41/99),其中t(15;17)检出率最高占AML的8.1%(8/99),为AML-M3诊断分型的遗传标志,而t(8;21)出现在AML-M2a中占4%(4/99),M2a患者伴t(8;21)对化疗治疗的敏感性及缓解率均较高,预后良好[13]。MDS与细胞遗传、分子遗传、免疫机制及骨髓微环境异常等相关,极易向AML转化[14-15],本研究MDS异常染色体核型检出率为64.2%,染色体以多发异常以及不平衡异常为主[15-16]。MM染色体异常多为复杂异常,常提示预后不良,本研究中MM异常染色体核检出率为19.5%(16/82),符合文献报道 MM 初诊时染色体异常克隆的检出率18%～35%[17],16例异常染色体中以涉及多条染色体的结构异常数目异常的复杂和高度复杂畸变为主,其中3例为-13伴有其他染色体多发异常,预后不良。CMPD、NHL和CMML异常染色体检出率分别为16.0%(4/25)、14.8%(4/27)和42.9%(3/7),NHL表现为多发异常,其中3例出现多个标记染色体(mar),CMPD和CMML出现染色体异常以结构异常为主,少见数目异常,缺少标记性染色体异常,可能跟病例数较少有关。

3.3 CML分子遗传和细胞学结果分析

CML是一种起源于造血干细胞的多系骨髓增生性肿瘤,其细胞遗传学特征是t(9;22)形成一个缩短的22号染色体(Ph染色体),Ph染色体形成同时产生BCR-ABL融合基因,BCR-ABL是CML的重要诊断依据[18],Ph染色体不仅能够对用于区分MDS、CML和类白血病,CML根据有无Ph染色体又分为Ph+型和Ph-型,Ph-型为异质性疾病,其中约50%出现BCR-ABL阳性,也属于Ph+型CML,治疗效果和预后均较差[19]。本研究33例CML患者通过两种技术分别检出Ph染色体和BCR-ABL融合基因31例,均为Ph+型和BCR-ABL阳性,CML中Ph染色体阳性率93.9%,与文献报道的CML患者中Ph染色体检出率的90%～95%一致[20],其中染色体核型分析发现3例额外异常染色体,FISH和染色体核型分析技术分别从分子遗传和细胞遗传学方面提供了不同的遗传学信息,丰富了CML患者遗传学改变的信息。

研究表明,CML患者Ph+伴额外染色体常预示着疾病向加速及急变期发展,预后较差[21]。有学者研究发现CML患者Ph+伴额外染色体其细胞生成和分子应答率明显降低,患者应答时间延长,是伊马替尼治疗CML患者的不良预后因素之一[22]。本研究中慢性期患者无额外异常染色体,在加速期和急变期患者中,出现额外异常染色体3例,其中1例患者为CML急变期,FISH检测BCR-ABL阳性,染色体核结果为复杂隐匿性Ph染色体合并额外染色体异常,该患者白细胞升高、轻度贫血、脾大,骨髓涂片、流式细胞学和骨髓活检提示CML急髓变,临床诊断为慢性粒细胞白血病急髓变,存在病情急剧进展可能,预后较差,需进一步联合化疗和骨髓移植治疗,额外染色体的出现对病例恶化具有重要的预测价值,两者联合应用可为临床CML诊断分型提供了更加全面的参考依据[23]。

综上所述,本研究通过优化改良短期骨髓染色体培养方法,提高了骨髓染色体培养成功率及异常染色体检出率,建立了适合推广使用的骨髓染色体G显带制备方法;发现不同血液病染色体异常检出率和类型也不相同,部分具有一定的特异性,骨髓染色体和FISH技术联合应用为临床对白血病诊断分型、治疗及预后判断提供了重要参考依据。

作者贡献

李付广,张晓静等进行文章构思、设计、实施、收集并整理数据、撰写论文;汤素环,唐江进行数据收集,统计学处理;吴爱娟进行数据质量控制;谢小雷,尹卫国进行论文的修订、监督管理。

本文不存在任何利益冲突。