基于微流控芯片的POCT 化血凝检测装置

毛 敏，高志忠，张如超，陈宇杰，刘文琮，张南刚，2

（1.武汉纺织大学电子与电气工程学院，湖北武汉 430200；2.智能微纳医学检验装备及关键技术湖北省工程研究中心，湖北武汉 430200）

血液凝固检测是心脑血管及血栓类疾病的重要检测项目，对于患者的早期检查、术前风险性评估[1]、抗凝药物口服[2]都有着重要的指导意义。在临床情况下，精确控制血液凝固和快速逆转抗凝治疗都至关重要[3]。凝血酶原时间（PT）是血凝四项之一，广泛应用于临床诊断。该项血凝检测指标可用于监测患者术前、围术期和术后血凝状态[4]，指导患者接受抗凝治疗，调节血凝状态[5]。该指标对患者的输血指导[6]、创伤性凝血功能障碍的紧急管理、血栓防治[7]、出血量控制和靶向止血治疗[8]有重要意义。传统的血凝检测是按固定的时间间隔访问医院，通过台式设备进行PT 检测。这种做法既费时又昂贵，检测不及时可能带来不幸的后果[9]。基于微流控技术的诊断仪器有微型化和集成化的特性，高度契合POCT 的发展需求，基于微流控技术的血凝检测展现出良好的应用前景[10]。该文选择具有高透气性且透气速率稳定的PDMS 材料[11]，通过微加工工艺制作出一种用于血凝检测的微流控芯片，再依托嵌入式技术、图像采集与分析技术，研制了基于微流控芯片的POCT 化血凝检测装置。

1 装置整体设计

该装置由主控模块、屏幕模块、图像采集模块、负压发生模块组成。检测装置整体设计如图1所示。

图1 装置整体设计

主控模块是整个系统的核心，通过插接件与其他模块连接。其主要功能是控制其他各模块实现功能，保证整个系统的正常运行。

屏幕模块的主要功能是通过触摸屏显示GUI 界面来实现与人的触摸交互。屏幕模块使用800×480分辨率的5 英寸IPS 屏幕面板，使用并行的24 位RGB接口。触摸屏幕芯片为GT911，使用的通信接口为IIC。GT911 所允许的最大通信频率为400 kHz，IIC时钟线和IIC 数据线接了一个RC 低通滤波器，用以滤除高频干扰。驱动单片机外设的LTDC 屏幕驱动器的硬件初始化，通过LTDC 驱动RGB565 制式的LCD 屏幕显示相应内容。检测装置运行界面如图2所示。

图2 检测装置运行界面示意图

图像采集模块包含摄像头、变焦镜头和补光灯。摄像头对微流控芯片进行图像采样，将采集所得的图像传入主控模块。变焦镜头则负责图像采集范围和焦点的控制。补光灯在摄像头采集数据时进行补光，辅助合适颜色、亮度的光线，以实现高质量图像采集。图像采集的准确性决定了装置检测的精确度。装置所使用摄像头的快门速度与采样增益均是可控的，再搭配补光灯，构建了一整套图像采集系统。传感器曝光时间、传感器采样增益和补光灯强度三者共同决定了采集图片的曝光度。过高或过低的曝光度都会使得图像数据失真，合理曝光的图像才满足检测条件。摄像头驱动程序通过SCCB 总线协议完成对摄像头传感器与内置DSP（Digital Signal Processing）的初始化，实现单片机DCMI 接口的硬件初始化，通过DCMI 数据接口实现对摄像头位图数据、帧中断的读取，进而将完整图像数据传回主控芯片，用于后续数据的处理。补光灯驱动程序实现了WS2812 芯片的驱动，通过DMA 总线搬运数据、SPI 总线发送数据，完成对搭载WS2812 芯片的LED 灯珠的亮度、色彩控制，为摄像头采集过程补光。变焦镜头可根据采样范围进行位置调整，可以等比例的缩放所拍摄区域的像素，以适配检测区域的尺寸。摄像头、变焦镜头及补光灯结构布局如图3 所示。

图3 图像采集模块结构布局图

负压发生模块包括负压泵和导气机构。通过A4988 驱动器驱动42H48 步进电机转动，结合光电传感器完成负压泵的复位和运动控制，实现任意速度的运动和任意位置的启停，配合注射器为微流控芯片提供负压源。导气机构通过驱动伺服舵机带动硅胶气嘴伸缩实现导气机构与血凝检测芯片导气嘴的接合与分离。导气机构满足了微流控芯片与负压泵的快速替换，同时保证接合的稳定性，为负压提供一个稳定的气体通路。通过3D 建模、打印、组装及调试，血凝检测装置实物如图4 所示。

图4 血凝检测装置实物图

2 微流控血凝检测芯设计与制作

该装置所使用微流控血凝检测芯片是自主设计和制作的。该芯片具有两个功能区域：血凝样本检测区和叉指负压区。检测区微通道处于上层玻璃中，负压区微通道处于底层PDMS 中，通过键合工艺实现整个芯片的装配。检测区为蛇形通道，供检测样本在负压驱动下流动；负压区为叉指型微通道，由于PDMS 具有较好的透气性和稳定的透气速率，当一侧叉指通道与负压泵相连时，与检测区相连的另一侧叉指通道中在较短时间内将产生一个稳定的负压，可用于稳定地驱动检测区微通道中血液的流动。芯片结构示意图如图5 所示。

图5 芯片结构示意图

血凝样本检测区微通道宽度为500 μm，高度为100 μm，蛇形通道总长度约为160 mm，样本检测区通道的内部体积很小，减少了PT 检测所需的血样用量和试剂用量。降低了检测成本。叉指负压区微通道宽度为400 μm，高度为100 μm，相邻叉指微通道间隔为160 μm。叉指结构可以更好的利用PDMS 材料的透气性。

3 凝血酶原时间测试

3.1 检测原理及方法

血液凝固是一种动态的血液活动[12]，在凝固过程中，可溶性纤维蛋白原转化为不溶性的纤维蛋白，血液在形态学上将发生变化，逐渐由流动态转变为不可流动的凝胶态。凝血酶原时间检测原理是将待测样本加入过量的含钙组织凝血活酶，重新钙化的血浆在存在组织因子时，激活因子X成为Xa，后者使凝血酶原转化为凝血酶[13]。凝血酶使纤维蛋白原转化变为不溶性纤维蛋白，在恒定的负压驱动下，待测血样将在检测区微通道中流动，随着血液黏度变大，流动速度逐渐降低，最后停止流动。测定整个凝固的时间即为待测样本的凝血酶原时间(PT)。

采用摄像头对整个血凝过程进行图像采集，然后对获得的图像进行分析处理，即可解析出PT 值。图像处理过程如下：先将采集的图像转为灰度图像；然后转为二值图像；进而对图像像素进行识别，得出色度占比结果；最后通过解析色度占比曲线来确定检测起点和终点。

血液流经区域在二值图像内显示为黑色占比为P1，血液未流经区域在二值图像内显示为白色占比为P2，可定义色度占比为P0=P1（/P1+P2）。通过绘制色度占比曲线（即凝固曲线），再利用一阶求导法即可确定凝固终点时间。

3.2 PT测定实验及结果分析

取某同学血样作为标准样本，开展了两组实验进行PT 测试实验；1）实验组：血样+凝血检测试剂；2）对照组：纯血样。

所用检测试剂是凝血酶原时间测定试剂盒（冻干型，凝固法），每瓶凝血酶试剂都应以瓶体标识体积添加缓冲液，轻轻摇动溶解，复溶后的试剂在-2～8 ℃环境下可保存7 天；采用含有1/10 体积0.109 mol/L 枸橼酸钠抗凝液[14-15]的塑料管或硅化玻璃管作为储血容器进行静脉采血[16]，采集后轻轻颠倒8 次将血样与缓冲液混匀，在此过程中应避免溶血及组织液污染[17]。样本在-2～8 ℃保存时,不宜超过6 h；22～24 ℃保存时,不宜超过2 h[18]。装置开机后设置相关参数；装入血凝检测芯片，点击“开始测试”按钮，硅胶吸盘气嘴在舵机控制下与导气孔紧密连接，至此等待装置负压建立完毕；屏幕提示可以开始注样时，取37 ℃预热的凝血检测试剂0.2 mL 与37 ℃预热3 min的待测血样0.1 mL加入塑料中，应当注意，凝血酶试剂预温不可超过15 min，血样预温不宜超过5 min；将二者轻微搅拌混合；然后将混匀后的待测样本加入血凝检测芯片进样孔；然后启动摄像头全程采集检测区图像；经图像处理后绘制出的色度占比曲线如图6 所示，然后利用一阶求导法对图6 所示曲线进行解析。实验结果如下：实验组PT 值约为12.8 s，而对照组PT 值趋近于无穷大。

图6 色度占比曲线

4 结束语

该文提出了一种基于微流控芯片的POCT 化血凝检测技术，并完成了微流控芯片及检测装置的设计和制作，最后利用血样标本在该装置上完成了实验组和对照组凝血酶原时间的测定，实验结果准确可靠。该文创新性地将负压抽取技术与微流控技术相结合，从而实现了POCT 化的血凝检测，再结合嵌入式技术、图像采集和分析技术研发出高度集成化的装置。该装置具有体积小巧、便于携带、操作简便、检测成本低、检测效率高和检测速度快等优点，可供基层社区医院使用或者患者居家自测，具有广阔的市场应用前景。