离子色谱法测定人凝血因子Ⅷ中钙离子含量

冯建杰,周长明,郜昭慧（北京市药品检验研究院,国家药品监督管理局仿制药研究与评价重点实验室,中药成分分析与生物评价北京市重点实验室,北京 102206）

离子色谱法是采用高压输液泵将洗脱液泵入色谱柱中，对可解离物质进行分离测定的色谱方法，广泛用于测定无机阴离子、无机阳离子、有机酸、糖等成分的含量，在药品质量分析领域发挥着重要作用[1-6]。

凝血因子Ⅷ的生理作用是在血管出血时被激活，和血小板粘连在一起并且补塞血管上的漏口，这个过程被称为凝血[7]。在血友病中，80%的病人患有血友病A，该类病人主要缺少正常人所拥有的凝血因子Ⅷ[8-9]。我国市场上除了德国拜耳公司的重组凝血因子Ⅷ，其他均为国内企业生产，均从血液中提取。钙离子在凝血中扮演着非常重要的角色，钙离子能够促进凝血因子的激活，在凝血过程中，凝血因子需要被激活才能发挥作用[10-14]。而钙离子能够与凝血因子相互作用，促进其激活，从而加速凝血过程。此外，钙离子还能够促进血小板的聚集，增强血小板与血管壁的黏附力，从而形成血栓，防止血液过度流失。本论文中建立了测定人凝血因子Ⅷ中钙离子含量的离子色谱方法，该方法专属性强，灵敏度高，比传统钙离子测定所用的试剂盒及原子吸收法提高了准确率和工作效率，可准确测定样品中钙离子含量，为更好地把控该品种质量提供了依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 Thermo ICS-3000型离子色谱仪，AERS 500型抑制器（规格为4mm），均购自赛默飞世尔科技公司；Arium Pro型超纯水机购自德国赛多利斯公司；XA205型电子分析天平购自梅特勒-托利多仪器有限公司，精度为十万分之一。

1.2试药 钙离子标准溶液购自中国计量科学研究院，批号为17083，质量浓度为1000μg/mL；人凝血因子Ⅷ来自于两个厂家（A厂家：批号分别为202211080，202211082，202 301005；B厂家：批号为B20221004）。

2 方法与结果

2.1溶液的制备 精密量取0.5、1.0、1.5、2.0，2.5mL质量浓度为25mmol/L的钙离子标准溶液，分别置于25mL容量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；取供试品一支，用10ml注射用水复溶，摇匀作为供试品溶液；取注射用水作为空白溶剂。

2.2色谱条件 色谱柱：CS12A阳离子交换柱（250mm×4mm）或效能相当的色谱柱；流动相：0.025mol/L甲烷磺酸溶液；使用电导检测器，使用CSRS ULTRAⅡ4mm抑制器，抑制电流为90mA；流速1.0mL/min；检测器温度为35℃；进样量25μL。

2.3方法学考察 参照2020版《中国药典》第四部9101药品质量标准分析方法验证指导原则进行方法学考察。

2.3.1专属性 取2.1项下对照品溶液、供试品溶液和空白溶剂各25μL，照2.2项下色谱条件进样分析，色谱图见图1。结果表明，空白溶剂色谱图中在主成分峰位置处无峰检测到，对测定结果不产生干扰。供试品溶液色谱图中色谱峰与对照品溶液色谱图中色谱峰保留时间一致。

2.3.2线性关系与定量限检测限 取质量浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mmol/L的系列对照品溶液，照2.2项下色谱条件分别注入离子色谱进行分析，以钙离子质量浓度（X，mmol/L）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为Y=12.618X-0.467，r=0.9998（n=5）。取质量浓度为1.5mmol/L钙离子对照品溶液，用纯化水逐级稀释，并进行离子色谱检测，记录峰面积及S/N值，以S/N=3时测得量为检测限，S/N=10时测得量为定量限。测得检测限为0.0003mmol/L，定量限为0.0006mmol/L。线性关系表明，钙离子在0.5-2.5mmol/L质量浓度范围内与峰面积线性关系良好。

2.3.3精密度试验 取质量浓度为1.5mmol/L对照品溶液，按2.2项下色谱条件连续进样测定6次。结果钙离子峰面积的RSD为1.00%（n=6），证明此仪器精密度良好。

2.3.4重复性试验 取样品（批号为202211080）适量，照2.1项下方法平行制备6份供试品溶液，并照2.2项下方法进行样品定量测定。钙离子含量的RSD为1.14%（n=6），证明此方法重复性良好。

2.3.5稳定性试验 取样品（批号为202211080）适量，照2.1项下方法制备供试品溶液，于室温下放置0、2、4、8、12、24小时，照2.2项下色谱条件分别于规定时间进样测定。钙离子峰面积的RSD为0.91%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置24小时内稳定性良好。

2.3.6加样回收试验 取已知含量的样品1支，用10mL注射用水复溶，摇匀为供试品溶液。精密量取质量浓度为25mmol/L对照品溶液0.12、0.15、0.18mL，分别置于2.5mL容量瓶中，各质量浓度平行制备3份，用供试品溶液稀释至刻度。取上述溶液，按2.2项下色谱条件进样测定，采用外标法计算加样回收率。钙离子回收率平均值为99.70%，RSD为0.76%（n=9），证明此方法准确度良好。

2.4样品中钙离子含量测定 随机取样品4批（批号分别为202211080，202211082，202301005，B20221004）样品，照2.1项下制备供试品溶液。分别采用离子色谱法以及现行标准中试剂盒法、原子吸收法测定钙离子的含量，结果见表1。

表1 离子色谱法与其他方法测定钙离子含量结果比较(mmol/L)

3 讨论

现行版中国药典中并未对人凝血因子Ⅷ中钙离子进行控制，国内厂家执行的国家药品标准YBS0126201中以试剂盒法测定钙离子的含量，国家药品标准YBS00172020中以原子吸收法测定钙离子的含量。在实验操作过程中发现，原子吸收法测定钙离子含量前处理复杂，耗费检验时间，测定过程中乙炔气体的燃烧有潜在危险性，且有可能造成结果误差大。而试剂盒法所采用的试剂盒价格较贵且效期短，对于不能集中时间进行测定的样品实验材料损耗较大。有研究[15-16]表明，离子色谱法不仅操作简便、快捷高效，还能同时测定镁、钙、钠、钾等多种金属离子。本文建立的离子色谱法测定人凝血因子Ⅷ中钙离子含量，操作简便、准确度高、样品消耗量少，可在线自动连续检测，极大地缩短了检验时限。此方法可进一步提高对本产品的质量控制，为该品种全面质量控制提供科学依据。