氟胁迫条件下茶树叶部实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选与验证

李庆会 李睿 温晓菊 倪德江 王明乐 陈玉琼

收稿日期：2023-12-16             修訂日期：2024-01-03

基金项目：国家自然科学基金项目（31972463）

作者简介：李庆会，女，博士研究生，主要从事茶叶安全生产与品质调控方面的研究。*通信作者：chenyq@mail.hzau.edu.cn

摘要：为了筛选氟胁迫条件下茶树（Camellia sinensis）叶部用于实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析的内参基因，以课题组前期筛选的低氟茶树品种福鼎大白茶和高氟茶树品种金观音为试验材料，利用qRT-PCR技术结合geNorm、NormFinder和BestKeeper软件，分析氟胁迫条件下（0.42 mmol·L-1 NaF）8个候选内参基因（CsACTIN、CsEF-1α、CseIF-4α、CsGAPDH、CsPP2A、CsTBP、CsTIP41和CsUBC）在茶树不同叶位（新梢和老叶）、不同胁迫时间（0、1、3、7 d）的表达稳定性。结果显示，在氟胁迫条件下，茶树新梢中最优内参基因组合是CsEF-1α、CsTIP41、CsTBP和CsACTIN，老叶中最优内参基因组合是CsPP2A和CsUBC。利用筛选得到的最优内参基因组合分析氟输出蛋白基因（CsFEX）的表达情况，发现CsFEX在两个茶树品种的新梢和老叶中的表达趋势一致，说明筛选的内参组合可用于氟胁迫条件下茶树新梢和老叶中目的基因的检测。

关键词：茶树；氟；内参基因；实时荧光定量PCR；基因表达

中图分类号：S571.1；Q52             文献标识码：A               文章编号：1000-369X（2024）01-027-10

Selection and Validation of Internal Reference Genes for qRT-PCR Analysis under Fluoride Stress in

Camellia sinensis Leaves

LI Qinghui， LI Rui， WEN Xiaoju， NI Dejiang， WANG Mingle， CHEN Yuqiong*

National Key Laboratory for Germplasm Innovation and Utilization of Horticultural Crops， College of Horticulture and Forestry Sciences， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China

Abstract： In order to screen the internal reference genes for quantitative real-time PCR analysis in tea leaves under fluoride stress， the low-fluoride cultivar ‘Fuding Dabaicha and the high-fluoride cultivar ‘Jinguanyin were used as experimental materials according to the fluoride evaluation results in these tea cultivars previously. The qRT-PCR technology combined with three Excel-based algorithms （geNorm， NormFinder and BestKeeper） were used to analyze the expression stabilities of eight candidate reference genes （CsACTIN， CsEF-1α， CseIF-4α， CsGAPDH， CsPP2A， CsTBP， CsTIP41 and CsUBC） in tea leaves （shoots and old leaves） under fluoride treatment （0.42 mmol·L-1 NaF） for different time periods （0， 1， 3， 7 d）. The results indicate that under fluoride stress， the optimal combination of reference genes in tea shoots was CsEF-1α， CsTIP41， CsTBP and CsACTIN and the optimal combination of reference genes in old leaves was CsPP2A and CsUBC. Moreover， to further confirm the stability of the selected reference genes， the expression levels of CsFEX in tea shoots and old leaves were analyzed using their corresponding optimal internal reference gene combinations. The expression profiles of CsFEX in tea shoots or old leaves between the two cultivars were consistent， indicating that the combinations of four and two internal reference genes were sufficient for normalizing the target gene expression in tea shoots and old leaves under fluoride stress， respectively.

Keywords： Camellia sinensis， fluoride， reference genes， quantitative real-time PCR， gene expression

氟是自然界中广泛存在的一种非金属元素，也是人体必需的微量元素之一。适量摄入氟可以促进人体骨骼和牙齿的生长，有利于人体健康，而长期大量摄入氟，会造成氟中毒，出现氟斑牙和氟骨症等[1]。茶树（Camellia sinensis）是一种氟富集植物，对氟胁迫具有较高的耐受性[2]。茶树的叶片是其积累氟的主要器官，新梢中的氟含量低于成熟叶，老叶中氟含量最高[3]。在自然生长环境中，虽然茶树富集氟，但鲜有茶树受到氟毒害的报道。在水培条件下，一定浓度的氟胁迫会影响茶叶中茶多酚、氨基酸、儿茶素、芳香化合物等物质的合成，不利于茶叶优良品质的形成；高浓度的氟胁迫会使茶树生长受阻，甚至死亡[4-5]。茶树富集氟受土壤环境、茶树基因型等多种因素影响[6]，因此，有必要研究茶树中参与氟代谢的功能及调控基因，全面了解茶树对氟的吸收、转运和富集的分子机制，针对性地提出茶树降氟措施，进而提升茶叶饮用安全。

实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点，已被广泛应用于目标基因在转录水平的检测和定量研究[7-9]，然而，qRT-PCR结果的准确性受RNA质量、引物的特异性、内参基因的稳定性等因素影响[10-11]。理想的内参基因应在各种条件下都能稳定的表达，但目前常见的内参基因在不同条件、不同物种、不同组织或不同发育阶段的表达并非绝对稳定[12-15]。在研究某些特定条件下的基因表达时，内参基因选择不合理会影响分析结果的准确性，因此有必要对所选内参基因的表达稳定性进行鉴定。

茶树中常用的内参基因有肌动蛋白基因（CsACTIN）、转录延伸因子基因（CsEF-1α）、真核生物翻译起始因子基因（CseIF-4α）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（CsGAPDH）、蛋白磷酸酶基因（CsPP2A）、TATA-box结合蛋白基因（CsTBP）、TIP41-like家族蛋白基因（CsTIP41）和泛素蛋白连接酶基因（CsUBC）[16-21]。已有研究表明，在茶树不同组织中β-肌动蛋白基因（Csβ-actin）的表达较稳定，在不同成熟度茶树叶片和愈伤组织中CsGAPDH基因的表达较稳定[22]；冷害、干旱、伤害和盐胁迫下CsGAPDH在茶树幼叶中的表达稳定性较好[23]；不同氮浓度和氮源处理下，CsGAPDH或Csβ-actin的表达稳定性较好，CsGAPDH和Csβ-actin组合的表达稳定性最好[24]。然而，尚未见有关氟胁迫条件下茶树内参基因的报道。

本研究以课题组前期筛选得到的低氟茶树品种福鼎大白茶和高氟茶树品种金观音为试验材料，进行氟胁迫处理（0.42 mmol·L-1 NaF），系统分析不同处理时间点（0、1、3、7 d）茶树新梢和老叶中的8个候选内参基因（CsACTIN、CsEF-1α、CseIF-4α、CsGAPDH、CsPP2A、CsTBP、CsTIP41和CsUBC）的表达稳定性，并利用氟输出蛋白基因（CsFEX）验证所选内参基因的稳定性，以期筛选出较优的内参基因，为进一步开展茶树响应氟胁迫的分子生物学研究提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 茶樹材料及处理

在本课题组对华中农业大学茶树种质资源圃中203份茶树材料氟含量评价的基础上，选择低氟茶树品种福鼎大白茶（ICR-22965）和高氟茶树品种金观音（ICR-23027）作为供试材料。试验所用茶苗为两年生无性系扦插苗，于2021年10月购于福建省福安市利农茶苗专业合作社。茶苗用清水洗净根部泥土后培养在华中农业大学南湖茶园温室大棚[昼/夜温度为24 ℃/20 ℃，14 h光照（200 μmol·m-2·s-1），10 h黑暗，相对湿度为70%]，利用茶树营养液[25]进行培养，每隔7 d更换1次营养液，6个月后对其进行氟胁迫（0.42 mmol·L-1 NaF）处理[26]，分别在第0、1、3、7 d采摘新梢（一芽二叶）和老叶（图1），液氮速冻后置于–70 ℃冰箱保存，用于RNA的提取。每个取样点设置3个生物学重复，共计48个样品。

1.2 总RNA的提取与第一链cDNA的合成

利用多糖多酚植物RNA提取试剂盒（华越洋，北京）提取茶树各样品的总RNA，使用Bioanalyzer 2100 System（Agilent，美国）检测RNA的浓度、纯度和完整性。利用PrimeScript? RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反转录试剂盒（TaKaRa，大连）将总RNA反转录为第一链cDNA，–20 ℃冰箱保存备用。

1.3 引物设计

根据茶树中已报道的内参基因[17，20-21]及其他物种中常用的内参基因[27-28]，筛选出CsACTIN、CsEF-1α、CseIF-4α、CsGAPDH、CsPP2A、CsTBP、CsTIP41和CsUBC等8个候选内参基因。利用Primer PREMIER 5.0软件设计各基因的特异性定量引物（表1）。利用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase（TaKaRa，大连）扩增基因的目的片段，使用E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit（OMEGA Bio-Tek，美国）回收产物，将其连接至pTOPO-Blunt Vector（艾德莱，北京）并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆后进行测序，进一步确认目的产物的正确性。引物序列合成和PCR产物测序均委托北京擎科新业生物技术有限公司完成。引物扩增效率的计算参照张秋悦等[15]的方法。

1.4 qRT-PCR分析

参照Bestar? SybrGreen qPCR Mastermix（DBI Bioscience，上海）使用手册，利用ABI Step One Plus? Real-Time PCR System（Applied Biosystems，美国）进行qRT-PCR分析。qRT-PCR反应体系：cDNA 1.0 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，Bestar? SybrGreen qPCR Mastermix 10.0 μL，50× ROX Reference Dye 0.4 ?L，ddH2O 7.8 μL。qRT-PCR

反应程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。每个反应设置3个技术重复。通过熔解曲线检测产物特异性：从65 ℃缓慢升温至95 ℃，每升温1 ℃采集5次荧光信号。反应结束后，根据各候选内参基因的Ct值分析其在氟胁迫条件下茶树新梢和老叶中的表达情况。

1.5 候选内参基因的表达稳定性评估

通过geNorm（version 3.4）[29]、NormFinder（version 20）[30]和BestKeeper（version 1）[31]统计软件对候选内参基因的表达稳定性进行评价。

1.6 内参基因的稳定性验证

为验证筛选得到的最优内参基因组合的稳定性，利用不同的内参基因组合对目的基因CsFEX的表达量进行归一化。利用算法[32]计算CsFEX的相对表达量。qRT-PCR反应体系和反应程序参照1.4章节。每个处理设置3个生物学重复。

2 结果与分析

2.1 内参基因引物的特异性

琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，8个候选内参基因的PCR扩增产物均为单一条带，说明各候选基因的qRT-PCR引物满足试验基本要求（图2A）。测序分析发现，扩增产物均为目的片段。熔解曲线分析显示，各基因的熔解曲线峰值重合率较高且只有单一主峰（图2B～图2I），表明各候选内参基因引物的特异性较好，可用于后续的试验。

2.2 候选内参基因的表达稳定性分析

2.2.1 候选内参基因的表达丰度

利用qRT-PCR分析了茶树8个候选内参基因在氟胁迫条件下的表达丰度。结果表明，候选内参基因的Ct值分布在26.16～30.69，CsUBC的表达丰度较高，CsPP2A的表达丰度相对较低（图3）。此外，Ct值的变化范围可以反映基因的表达稳定性，Ct值的变化范围越小，基因越稳定。由图3可知，CsEF-1α、CsTBP和CsPP2A的表达稳定性较高。

2.2.2 内参基因的最佳数量

为确保qRT-PCR结果的准确性，有时需要使用2个或2个以上内参基因对目标基因的表达量进行校正。可利用geNorm计算标准因子配对变异值V来确定最适合内参基因的数量，其中，0.15被普遍接受为临界值；当Vn/n+1＜0.15时，n个内参基因已达到校正目的基因表达量的要求；反之，则需使用n+1个内参基因进行校正。氟胁迫条件下，在茶树新梢中，V4/5值（0.129）最先小于0.15，表明在研究氟胁迫条件下，茶树新梢中最佳内参基因数是4个；在老叶中，V2/3值（0.113）小于0.15，表明最佳内参基因数是2个（图4）。

2.2.3 候选内参基因的表达稳定性

利用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个数据分析软件来分析氟胁迫条件下候选内参基因在茶树新梢和老叶中的表达稳定性。geNorm软件分析结果发现，8个内参基因的M值均低于1.5，表明它们均具有较好的稳定性。在新梢中，CsTBP和CsEF-1α表达稳定性最好，其次是CsACTIN和CsGAPDH；在老叶中，CsPP2A和CsGAPDH表达稳定性最好。NormFinder软件分析发现，在新梢中，CsEF-1α、CsTIP41、CsACTIN和CsTBP表达稳定性较好；在老叶中CsTIP41和CsUBC表达稳定性较好。BestKeeper软件分析显示，8个内参基因的标准偏差均小于1，表明它们具有较好的表達稳定性。在新梢中，CseIF-4α、CsTIP41、CsEF-1α和CsTBP表达稳定性较好；在老叶中，CsUBC和CseIF-4α表达稳定性较好。可能是由于软件对内参基因稳定性算法的不同，造成3种方法在稳定性评价结果上存在一定差异。综合分析显示，新梢中最佳内参基因组合为CsEF-1α、CsTIP41、CsTBP和CsACTIN，老叶中最佳内参基因组合为CsPP2A和CsUBC（表2）。

2.3 最适内参基因稳定性验证

CsFEX通过外排氟离子调控茶树对高浓度氟的耐受性，其表达量在高浓度氟条件下显著升高[26]，因此本研究使用CsFEX来验证所筛选得到的内参基因的可靠性。以稳定性较好的CsEF-1α、CsTIP41、CsTBP和CsACTIN作为

茶树新梢内参基因，CsPP2A和CsUBC作为茶树老叶内参基因，分析CsFEX在福鼎大白茶和金观音新梢和老叶中的相对表达量。结果发现，CsFEX在两个品种新梢和老叶中的表达趋势一致，表达量都是先升高后降低，在第3天达到最高值（图5），说明所筛选的内参基因组合可用于检测氟胁迫条件下茶树新梢和老叶中目的基因的表达量。

3 讨论

近年来，qRT-PCR技术被广泛应用于基因的表达分析，而内参基因选择是否合理关系到qRT-PCR结果的准确性[33-35]。因此，研究特定试验条件下基因的表达量变化时先对内参基因进行筛选具有一定的必要性。

研究发现，CsTBP和CsTIP41的表达量在茶树叶片发育过程中比较稳定[12]。本研究中，CsTBP和CsTIP41在茶树新梢中的表达稳定性较好，适合作为研究氟胁迫条件下茶树新梢中基因表达的内参基因。GAPDH是较常用的内参基因之一，在杜梨叶片[15]、秋石斛花芽[28]、山茶不同组织或不同发育程度的花瓣中表达稳定性较好[36]；在茶树的冷害、干旱、盐胁迫及不同氮浓度和氮源处理下，CsGAPDH的表达也比较稳定[23-24]。本研究发现，8个候选内参基因中，CsGAPDH在茶树新梢和老叶中的表达稳定性均不是最好，这说明氟胁迫条件下，CsGAPDH并不是最佳的内参基因。CsEF-1α和CsACTIN在茶树新梢中的表达稳定性较好，在老叶中稳定性较差；而在茶树老叶中表达比较稳定的CsPP2A和CsUBC在新梢中表达稳定性较差，这说明同一内参基因并非在所有的情况下都有较稳定的表达。孙美莲等[22]研究发现，ACTIN和UBC等适合作为非生物胁迫研究中的内参基因。肌动蛋白是细胞器骨架的重要组成成分，可以通过减少ACTIN的表达，调节细胞周期，防止细胞凋亡，从而稳定细胞骨架[37]；UBC是泛素蛋白酶体途径的重要组分，识别和清除非生物胁迫下产生的异常蛋白[38]。基于此，推测在氟胁迫条件下，为了减少胁迫损伤，植物体可能调动多种基因响应逆境胁迫，最终引起这些内参基因的表达量变化。综上所述，在不同的植物组织和试验条件下，内参基因的稳定性存在差异，应根据具体的试验条件选择较稳定的内参基因。

本研究使用geNorm、NormFinder和BestKeeper数据分析软件，对候选内参基因进行稳定性分析。结果发现，在氟胁迫条件下，茶树新梢中最优内参基因组合是CsEF-1α、CsTIP41、CsTBP和CsACTIN，老叶中最优内参基因组合是CsPP2A和CsUBC，这为后续开展氟胁迫条件下茶树相关基因的研究奠定了基础。

参考文献

[1]Fan Z P， Gao Y H， Wang W， et al. Prevalence of brick tea-type fluorosis in the Tibet Autonomous region [J]. Journal of Epidemiology， 2016， 26（2）： 57-63.

[2]沙济琴， 郑达贤. 茶树黄棪对氟的生物积累特征[J]. 福建茶叶， 1993（3）： 25-28.

Sha J Q， Zheng D X. The bioaccumulation characteristics of fluoride in Camellia sinensis ‘Huangdan [J]. Tea in Fujian， 1993（3）： 25-28.

[3]马立锋. 茶树对氟吸收累积特性及降氟措施研究[D]. 杭州： 浙江大学， 2004.

Ma L F. Study on accumulation and distribution of fluoride in tea plants （Camellia sinensis） and its measure of reducing fluoride uptake [D]. Hangzhou： Zhejiang University， 2004.

[4]Li C L， Ni D J. Effect of fluoride on the amino acid composition of tea leaves [J]. Fluoride， 2016， 49（3）： 266-270.

[5]Yang X， Yu Z， Zhang B， et al. Effect of fluoride on the biosynthesis of catechins in tea [Camellia sinensis （L.） O. Kuntze] leaves [J]. Scientia Horticulturae， 2015， 184： 78-84.

[6]Ruan J Y， Ma L F， Shi Y Z， et al. Uptake of fluoride by tea plant （Camellia sinensis L） and the impact of aluminium [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2003， 83（13）： 1342-1348.

[7]Bustin S A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR （RT-PCR）： trends and problems [J]. Journal of Molecular Endocrinology， 2002， 29（1）： 23-39.

[8]喬永刚， 王勇飞， 曹亚萍， 等. 药用蒲公英低温和高温胁迫下内参基因筛选与相关基因表达分析[J]. 园艺学报， 2020， 47（6）： 1153-1164.

Qiao Y G， Wang Y F， Cao Y P， et al. Reference genes selection and related genes expression analysis under low and high temperature stress in Taraxacum officinale [J]. Acta Horticulturae Sinica， 2020， 47（6）： 1153-1164.

[9]马璐琳， 段青， 崔光芬， 等. 钝裂银莲花花色素合成相关基因qRT-PCR内参基因的筛选[J]. 园艺学报， 2021， 48（2）： 377-388.

Ma L L， Duan Q， Cui G F， et al. Selection and validation of reference genes for qRT-PCR analysis of the correlated genes in flower pigments biosynthesis pathway of Anemone obtusiloba [J]. Acta Horticulturae Sinica， 2021， 48（2）： 377-388.

[10]Nolan T， Hands R E， Bustin S A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR [J]. Nature Protocols， 2006， 1（3）： 1559-1582.

[11]Bustin S A， Benes V， Garson J A， et al. The MIQE guidelines： minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments [J]. Clinical Chemistry， 2009， 55（4）： 611-622.

[12]Wu Z J， Tian C， Jiang Q， et al. Selection of suitable reference genes for qRT-PCR normalization during leaf development and hormonal stimuli in tea plant （Camellia sinensis） [J]. Scientific Reports， 2016， 6： 19748. doi： 10.1038/srep19748.

[13]Nikalje G C， Srivastava A K， Sablok G， et al. Identification and validation of reference genes for quantitative real-time PCR under salt stress in a halophyte， Sesuvium portulacastrum [J]. Plant Gene， 2018， 13： 18-24.

[14]杨婷， 薛珍珍， 李娜， 等. 铁十字秋海棠斑叶发育过程内参基因筛选及验证[J]. 园艺学报， 2021， 48（11）： 2251-2261.

Yang T， Xue Z Z， Li N， et al. Reference genes selection and validation in Begonia masoniana leaves of different developmental stages [J]. Acta Horticulturae Sinica， 2021， 48（11）： 2251-2261.

[15]张秋悦， 刘昌来， 于晓晶， 等. 盐胁迫条件下杜梨叶片差异表达基因qRT-PCR内参基因筛选[J]. 园艺学报， 2022， 49（7）： 1557-1570.

Zhang Q Y， Liu C L， Yu X J， et al. Screening of reference genes for differentially expressed genes in Pyrus betulaefolia plant under salt stress by qRT-PCR [J]. Acta Horticulturae Sinica， 2022， 49（7）： 1557-1570.

[16]Hao X， Horvath D P， Chao W S， et al. Identification and evaluation of reliable reference genes for quantitative real-time PCR analysis in tea plant （Camellia sinensis （L.） O. Kuntze） [J]. International Journal of Molecular Sciences， 2014， 15（12）： 22155-22172.

[17]Wang M L， Li Q H， Xin H H， et al. Reliable reference genes for normalization of gene expression data in tea plants （Camellia sinensis） exposed to metal stresses [J]. PLoS One， 2017， 12（4）： e0175863. doi： 10.1371/journal.pone.0175863.

[18]Zhou Z W， Deng H L， Wu Q Y， et al. Validation of reference genes for gene expression studies in post-harvest leaves of tea plant （Camellia sinensis） [J]. Peer Journal， 2019， 7： e6385. doi： 10.7717/peerj.6385.

[19]Xu W， Dong Y， Yu Y， et al. Identification and evaluation of reliable reference genes for quantitative real-time PCR analysis in tea plants under differential biotic stresses [J]. Scientific Reports， 2020， 10（1）： 2429. doi： 10.1038/ s41598-

020-59168-z.

[20]Wang J X， Liu L L， Tang Q H， et al. Evaluation and selection of suitable qRT-PCR reference genes for light responses in tea plant （Camellia sinensis） [J]. Scientia Horticulturae， 2021， 289： 110488. doi： 10.21203/rs.3.rs-127369/v1.

[21]Zhang L Y， Zhang R M， Hu X L， et al. Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the shoots and roots of Camellia sinensis var. sinensis under nutritional stresses [J]. Scientia Horticulturae， 2023， 320： 112237. doi： 10.1016/j.scienta.2023.112237.

[22]孫美莲， 王云生， 杨冬青， 等. 茶树实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择[J]. 植物学报， 2010， 45（5）： 579-587.

Sun M L， Wang Y S， Yang D Q， et al. Reference genes for real-time fluorescence quantitative PCR in Camellia sinensis [J]. Chinese Bulletin of Botany， 2010， 45（5）： 579-587.

[23]郝姍. 茶树不同逆境条件下QRT-PCR适宜内参基因的筛选[D]. 南京： 南京农业大学， 2012.

Hao S. Selection of appropriate reference genes for expression studies in Camellia sinensis by real-time polymerase chain reaction [D]. Nanjing： Nanjing Agricultural University， 2012.

[24]刘圆， 王丽鸳， 韦康， 等. 不同氮处理茶树实时定量PCR内参基因筛选和验证[J]. 茶叶科学， 2016， 36（1）： 92-101.

Liu Y， Wang L Y， Wei K， et al. Screening and validation of reference genes for quantitative real-time PCR analysis in tea plant （Camellia sinensis） under different nitrogen nutrition [J]. Journal of Tea Science， 2016， 36（1）： 92-101.

[25]Wan Q， Xu R K， Li X H. Proton release by tea plant （Camellia sinensis L.） roots as affected by nutrient solution concentration and pH [J]. Plant Soil and Environment， 2012， 58（9）： 429-434.

[26]Zhu J J， Xing A Q， Wu Z C， et al. CsFEX， a fluoride export protein gene from Camellia sinensis， alleviates fluoride toxicity in transgenic Escherichia coli and Arabidopsis thaliana [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2019， 67（21）： 5997-6006.

[27]李永平， 叶新如， 王彬， 等. 黄秋葵实时荧光定量PCR内参基因的克隆与筛选评价[J]. 核农学报， 2021， 35（1）： 60-71.

Li Y P， Ye X R， Wang B， et al. Cloning and selection evaluation of reference gene for quantitative real-time PCR in Hibiscus esculentus L. [J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences， 2021， 35（1）： 60-71.

[28]侯天泽， 易双双， 张志群， 等. 秋石斛RT-qPCR内参基因的筛选与验证[J]. 园艺学报， 2022， 49（11）： 2489-2501.

Hou T Z， Yi S S， Zhang Z Q， et al. Selection and validation of reference genes for RT-qPCR in Phalaenopsis-type Dendrobium hybrid [J]. Acta Horticulturae Sinica， 2022， 49（11）： 2489-2501.

[29]Vandesompele J， De Preter K， Pattyn F， et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes [J]. Genome Biology， 2002， 3（7）： research0034.0031. doi： 10.1186/gb-2002-3-7-research0034.

[30]Andersen C L， Jensen J L， ?rntoft T F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data： a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization， applied to bladder and colon cancer data sets [J]. Cancer Research， 2004， 64（15）： 5245-5250.

[31]Pfaffl M W， Tichopad A， Prgomet C， et al. Determination of stable housekeeping genes， differentially regulated target genes and sample integrity： BestKeeper--Excel-based tool using pair-wise correlations [J]. Biotechnology Letters， 2004， 26（6）： 509-515.

[32]Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method [J]. Methods， 2001， 25（4）： 402-408.

[33]Gutierrez L， Mauriat M， Guenin S， et al. The lack of a systematic validation of reference genes： a serious pitfall undervalued in reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） analysis in plants [J]. Plant Biotechnology Journal， 2008， 6（6）： 609-618.

[34]Bustin S A， Nolan T. Pitfalls of quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction [J]. Journal of Biomolecular Techniques， 2004， 15（3）： 155-166.

[35]Derveaux S， Vandesompele J， Hellemans J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR [J]. Methods， 2010， 50（4）： 227-230.

[36]劉小飞， 于波， 黄丽丽， 等. 杜鹃红山茶实时定量PCR内参基因筛选及验证[J]. 广东农业科学， 2020， 47（12）： 203-211.

Liu X F， Yu B， Huang L L， et al. Screening and validation of reference genes of Camellia azalea by quantitative real-time PCR [J]. Guangdong Agricultural Sciences， 2020， 47（12）： 203-211.

[37]刘瑞姣， Abdulrahman A.A.Amer， 高兴华， 等. 肌动蛋白结构与生物学功能的研究进展[J]. 中国细胞生物学学报， 2020， 42（10）： 1870-1875.

Liu R J， Abdulrahman A， Gao X H， et al. Advances in research on the structure and biological function of actin [J]. Chinese Journal of Cell Biology， 2020， 42（10）： 1870-1875.

[38]王爽， 李海英. 植物E3泛素连接酶与非生物胁迫相关研究进展[J]. 中国农学通报， 2020， 36（29）： 47-53.

Wang S， Li H Y. Plant E3 ubiquitin ligase and abiotic stress： research progress [J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2020， 36（29）： 47-53.