不同水分管理栽培方式对山栏稻根际土壤细菌群落的影响

刘佳宁 李梦 杨新森 吴伟 裴新梧 袁潜华

（1.海南大学热带农林学院，海口 570228；2.中国农业科学院生物技术研究所，北京 100089）

海南山栏稻是黎族人民在长期实践中选育出来的一种独特旱稻，具有极其重要的应用价值［1-2］，然而山栏稻的栽培方式单一，传统的刀耕火种种植手段破坏环境，当地政府已明令禁止烧山毁林，山栏稻的种植面积逐年减少，品种失传率升高［3-4］。为进一步发展山栏稻产业，摒弃刀耕火种的种植模式，使这一传统民族产业得以发扬光大，有必要探索新的种植方式，山栏稻水作栽培是山栏稻种植的新模式。

山栏稻水作栽培方式可以有效地减少干旱胁迫，优化农艺性状，缩短生育期，显著增加山栏稻产量。山栏稻水作栽培还显著提高了剑叶光合速率和孕穗期叶绿素含量。相较于传统旱作栽培，山栏稻水作栽培提高了稻米加工研磨品质，降低了蒸煮食味品质，而外观品质没有明显变化［5-7］。

根际土壤微生物被称为植物的第二基因组，对植物至关重要［8］。在田间条件下，地理位置和耕作方式是造成土壤微生物群落变异的主要因素［9］。研究发现水田和旱地水稻显著改变了总体细菌和真菌群落组成，从水田到旱地，根系微生物多样性大大降低，不同的环境条件和水稻生态型导致了根系微生物群落的重组［10］。短期不同耕作方式的水稻根际土壤微生物群落结构和多样性存在差异，不同处理下微生物群落分布受土壤pH 值、有机质、碱解氮和速效磷影响［11］。近年来研究发现，根际土壤微生物可以影响宿主的营养发育和免疫［12-13］，对提高作物产量［14］、维持生态系统平衡和促进绿色农业发展具有重大意义［15-16］。同时，土壤微生物在不同栽培方式的变化情况也越来越受到学者的关注。水作和旱作是水稻的两种主要栽培方式，并且细菌相较于真菌对土壤含水量的改变更加敏感［17-18］，所以本试验采取不同水分管理栽培方式模拟山栏稻水作和旱作栽培，重点关注根际土壤细菌群落的变化情况，并结合根际土壤理化性质进行分析。

前人针对山栏稻水作栽培做了许多研究，包括对山栏稻水作后的抗病性、源库流特性、光合作用和产量的研究，但还没有对山栏稻水作后根际微生物群落的变化开展研究。本试验研究了山栏稻在不同水分管理栽培方式下的根际土壤细菌群落的变化，分析了土壤理化特性对根际土壤细菌群落丰度的影响，探究山栏稻在不同水分管理栽培方式下根际土壤细菌群落的变化机制，为山栏稻大田水作栽培技术的应用与推广提供技术支撑，促进山栏稻的发展和应用。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验选用3 个籼稻品种（湾岭5 号、黑米白沙、黄叶稻）和3 个粳稻品种（湾岭2 号、湾岭3 号、湾岭4 号）作为材料。其中黄叶稻为西南地区传统旱稻，其余均为海南山栏稻。

1.2 方法

1.2.1 试验设计与栽培管理 实验在海南省海口市美兰区人民大道58 号海南大学农科基地（北纬20.05°，东经110.32°）开展，本地属热带季风性气候，年平均气温、降水量和平均日照时长分别是24.3℃、2 067 mm 和2 000 h；地块肥力中等，土壤为砂壤土，有机质含量为 14.13 g/kg，碱解氮含量 94.3 mg/kg，有效磷含量为 24.38 mg/kg，速效钾含量为 135.51 mg/kg，pH 值为5.68。试验田以水泥田埂分隔开，分别由独立的灌溉和排水系统进行水分管理。采用双因素随机区组设计，设置品种和水分2 个因素，每个处理组合随机排列并设置3 次重复，共36 个小区，每个小区面积为1.8 m2（1.5 m×1.2 m）。实验材料种植的行距为25 cm，株距为20 cm，每个小区种植5 行，每行种植7 株。

水稻种子浸种、催芽后，育秧至三叶一心至四叶一心时再移栽到2 个田块中，正常灌溉处理除了分蘖期晒田，其他生育期保持深约 3-5 cm 的水层，成熟期让水自然落干；干旱管理处理分蘖期晒田后，其他生育期均不进行灌水，降雨后及时进行排水，保持田块干旱状态。各处理播种前按3 000 kg/hm2的量施有机肥作为底肥，撒施粉粒状有机肥后用旋耕机旋耕田地，松土的同时将有机肥旋打均匀，各处理于分蘖期再追施 1 次尿素（150 kg/hm2）。田间杂草和病虫害的防治按照常规水稻的管理方式进行。

1.2.2 根际土壤微生物采集、文库的构建和高通量测序 每个品种分别在正常灌溉、干旱管理处理中随机选取3 株水稻，剪掉植株上半部分，轻轻摇晃根部，抖落掉大块土壤，戴无菌手套进行揉捏，继续摇晃根部。将根放入装有25 mL PBS 缓冲液的50 mL 离心管中，涡旋振荡15 s。用灭过菌的镊子将根转移至一个新的装有25 mL PBS 缓冲液的50 mL 离心管中，继续涡旋振荡15 s。将2 个50 mL 离心管中收集到的土壤悬浊液用100 μm 尼龙网过滤至另一个新的50 mL 离心管中，10 000 r/min 离心5 min，倒掉上清液，离心管中的沉淀则为收集到的根际土，液氮速冻后放于‑80℃冰箱内进行保存。根际土壤采集完成后，将样品送至百迈客生物科技有限公司，采用3 代16S 测序技术进行测序，按照测序要求使用百迈客云的微生物多样性平台分析根际微生物多样性。

1.2.3 土壤理化性质的测定和分析 分别于2 个不同水分管理栽培处理的2 个田块随机取地下20 cm处的土样，混样后分成3 份，置于通风处晾干后用于测定土壤理化性质。土壤pH 值采用pH 计测定。有效钾（available k，AK）的测定参考NY/T 889‑2004，采用NH4OAc 溶液浸提，再用火焰光度法进行测定。有效磷（available P，AP）的测定参考NY/T 1121.1‑2014，采用NaHCO3溶液浸提，然后钼锑抗比色法进行测定。有机质（organic matter，OM）的测定参考DB12/T961‑2020，采用直接加热法测定有机质含量。碱解氮（alkeline‑n，AN）的测定参考NY/T 1121.24‑2012 进行测定。全氮（total nitrogen，TN）的测定采用凯式定氮法测定。测得数据后使用SPSS 进行分析。

2 结果

2.1 不同水分管理栽培方式山栏稻根际细菌群落特征比较

根际土壤样品测序、识别后共获得479 313 条CCS（circular consensus sequencing）序列，每个样品至少产生了9 046 条CCS 序列，平均产生13 314 条CCS 序列。使用Usearch 软件对Reads 在97.0%的相似度水平下进行聚类，共获得7 418 个OTU（opera‑tional taxonomic units）。优势细菌门为Proteobacteria、Firmicutes、Desulfobacterota，不同水分管理栽培方式改变了细菌群落的相对丰度但并未改变优势群落的种类（图1）。根际细菌群落的α 多样性不受水分的调节，两种栽培方式的Shannon 指数和Chao1 指数都未达到显著差异水平（图2）。PCoA（主坐标分析）和PERMANOVA（置换多元方差分析）结果发现不同水分管理栽培处理对山栏稻根际土壤细菌群落组成有较大影响（图3-4），栽培处理和品种都对根际土壤细菌群落组成有显著影响，栽培处理对根际细菌群落的影响较大（R2= 0.442，P = 0.001），品种对根际土壤细菌群落的影响较小（R2= 0.187，P= 0.004）；栽培处理是影响根际土壤细菌群落的主要因素（图4）。

图1 不同水分管理处理对根际土壤细菌群落门水平相对丰度的影响Fig.1 Effect of irrigated and drying treatment on the relative abundance of bacterial community in rhizosphere soil at phylum level

图2 不同水分管理处理的Alpha 多样性指数差异箱线图Fig.2 Box graph of differences in alpha diversity index between irrigated and drying treatment groups

图3 PcoA 分析Fig.3 PcoA analysis

图4 PERMANOVA 分析箱型图Fig.4 PERMANOVA analysis box diagram

2.2 不同水分管理栽培方式山栏稻根际细菌群落物种进化树分布

挑选出相对丰度TOP80 的特征序列构建系统进化树，这些OTU 分布在12 个细菌门，除了未分类细菌以外，变形杆菌门（19 个OTU）、脱硫菌门（13个OTU）、厚壁菌门（11 个OTU）、硝化螺旋菌门（10个OTU）、拟杆菌门（9 个OTU）分别为前五的细菌门。可以看出大部分核心OTU 之间的丰度比例有较大差异，极个别核心OTU 丰度比例差异极大，说明不同水分管理栽培处理对这些相对丰度较高的核心群落产生了较大的影响（图5）。

2.3 不同水分管理栽培方式山栏稻根际细菌群落组成比较

为了研究不同水分管理栽培方式的样品间根际土壤细菌群落丰度的差异，使用Metastats 软件对2个处理的物种丰度数据进行t 检验得到P 值，根据P 值筛选出导致两组样品组成差异的物种，在门水平达到显著差异的群落共有19 个门（表1），结果表 明Acidobacteriota、Armatimonadota、Fibrobactero‑ta、Myxococcota、Gemmatimonadota、Verrucomicrobi‑ota、Firmicutes 在正常灌溉中的相对丰度显著高于干旱 管 理；Bdellovibrionota、Sumerlaeota、Planctomy‑cetota、Dadabacteria、Dependentiae、Entotheonellae‑ota、Patescibacteria、Nitrospirota、Methylomirabilota、Calditrichota、Proteobacteria、Hydrogenedentes 在 正常灌溉中的相对丰度显著低于干旱管理。其中相对丰度前10 的菌门中，Acidobacteriota、Myxococcota、Verrucomicrobiota、Firmicutes 在正常灌溉中的相对丰度显著高于干旱管理；Nitrospirota、Proteobacteria在正常灌溉中的相对丰度显著低于干旱管理。

表1 不同水分管理栽培处理显著差异的细菌门群落Table 1 Bacterial phylum communities with significant differences in different water management cultivation treatments

2.4 土壤理化性质与根际土壤细菌群落的相关性分析

为了明确不同水分管理栽培方式对山栏稻根际土壤的影响，测定了影响土壤理化性质的相关指标，使用SPSS 进行独立样本t 检验，结果显示干旱管理栽培处理土壤中的氮、磷和有机质含量显著高于正常灌溉栽培，pH、有效钾含量显著低于正常灌溉栽培（表2）。对环境因子与相对丰度前10 的根际土壤细菌门群落进行Pearson 相关性分析，结果表明有效钾（AK）、pH 为一类；有效磷（AP）、有机质（OM）、碱解氮（AN）、全氮（TN）为一类。细菌门群落聚为3 类，Nitrospirota、Proteobacteria、unclassified_Bacteria 为一类，Verrucomicrobiota、Acidobacteriota、Myxococcota 为 一 类；Bacteroidota、Desulfobacterota、Chloroflexi、Firmicutes 为 一 类。AK、pH 与Nitro‑spirota、Proteobacteria、unclassified_Bacteria 显著负相关。AK、pH 与Verrucomicrobiota、Acidobacteriota、Myxococcota 显著正相关。AK、pH 与Bacteroidota、Desulfobacterota、Chloroflexi、Firmicutes 正相关，但只与Firmicutes 具有显著性。AP、OM、AN、TN 与Nitrospirota、Proteobacteria、unclassified_Bacteria 显著正相关。AP、OM、AN、TN 与Verrucomicrobiota、Acidobacteriota、Myxococcota 显著负相关。AP、OM、AN、TN 与Bacteroidota、Desulfobacterota、Chlorofle‑xi、Firmicutes 负相关，但只有AP、OM 与Chlorofle‑xi、Firmicutes、AN 与Firmicutes 具有显著性（图6）。

表2 不同水分管理栽培处理土壤环境因子的差异Table 2 Differences in soil environmental factors under different water management cultivation treatments

图6 环境因子与相对丰度前十的细菌门群落的相关性热图Fig.6 Heat map of correlation between environmental factors and the top ten bacterial communities with relative abundance

2.5 不同水分管理栽培方式的相关性网络分析

根据正常灌溉和干旱管理栽培中根际土壤细菌属水平群落的丰度以及变化情况，对2 个处理分别进行斯皮尔曼（Spearman）秩相关分析，并筛选相关性大于0.1 且P 值小于0.05 的数据构建物种相关性网络，正常灌溉处理的网络图相较于干旱管理处理的网络图拥有更多的节点数和更大的模块性，说明正常灌溉处理中有更多的细菌群落相互作用，正常灌溉处理的相关性网络更复杂（表3，图7）。

表3 不同水分管理栽培处理相关性网络属性Table 3 Network attributes of different water management cultivation treatment

图7 属水平各物种网络图Fig.7 Network Diagram of various species at the genus level

3 讨论

土壤微生物影响作物的生长发育［19］，栽培方式的改变会显著影响土壤微生物。不同水分管理栽培方式主要改变了土壤水分，而细菌群落对土壤水分的变化十分敏感［20］。短期不同耕作方式处理下水稻根际土壤微生物群落结构和多样性存在差异，不同处理下微生物群落分布受土壤pH 值、有机质、碱解氮和速效磷影响［21］。本研究利用16S rRNA 基因扩增序列探究了不同水分管理栽培方式对山栏稻根际细菌群落影响，鉴定了不同栽培方式下显著差异的细菌属，并分析了根际细菌群落和根际土壤理化性质之间的关联。

本试验结果显示，两种水分管理栽培方式下根际土壤优势细菌门均为Proteobacteria、Firmicutes、Desulfobacterota，不同水分管理栽培方式改变了细菌群落的相对丰度，但并未改变优势群落的种类。不同水分管理栽培方式对山栏稻根际土壤细菌群落的α 多样性无明显影响。这一结论与前人研究结果相似，干旱并不直接导致群落的死亡和新的群落的出现，而是保持根际群落的多样性相对稳定［22］。栽培方式显著地改变了根际细菌群落的组成，PCoA 分析显示正常灌溉和干旱管理的根际土壤细菌群落组成间存在明显差异。PERMANOVA 分析的结果显示栽培处理和品种都对根际土壤细菌群落组成产生了显著影响，并且栽培处理的影响大于品种的影响。物种进化树显示核心OTU 分布在12 个细菌门，大多数核心OTU 在两种栽培方式下存在相对丰度差异。前人研究了野生稻和栽培稻根际细菌群落，表明取样土壤位置是影响根际细菌群落组成的主要因素，其次是品种［23］。水分会显著影响根际土壤细菌群落的组成［24］。本试验中，不同水分管理栽培方式导致了土壤水分的差异，显著影响了山栏稻根际土壤细菌群落的组成，栽培方式的改变是导致山栏稻根际土壤细菌群落组成变化的主要原因。

相对丰度前10 的菌门中，Acidobacteriota、Myxococcota、Verrucomicrobiota、Firmicutes 在 正 常灌溉中的相对丰度显著高于干旱管理；Nitrospirota、Proteobacteria 在正常灌溉中的相对丰度显著低于干旱管理。Nitrosprota 是突发性旱涝交替后施氮条件下调节水稻根系氮素吸收的关键类群，在调节水稻氮素吸收方面有重要的作用，可能调控水稻胁迫条件下氮素的吸收［25］，Proteobacteria 对植物在干旱条件下的生存起着重要的作用，在干旱条件下Proteobac‑teria 群落丰度比水分充足条件下要更高，而Firmi‑cutes 群落丰度更低，进一步研究发现Proteobacteria门参与了碳和氮循环［26］。本研究中，Nitrosprota 和Proteobacteria 在正常灌溉中的相对丰度显著低于干旱管理，这可能是由于从干旱管理到正常灌溉，其水分胁迫因素减少，Nitrosprota、Proteobacteria 的相对丰度降低，这证明了Nitrosprota 和Proteobacteria可能是山栏稻应对干旱胁迫的关键细菌类群。Ac‑idobacteriota、Myxococcota、Verrucomicrobiota、Firmi‑cutes 在正常灌溉中的相对丰度高于干旱管理，其中Firmicutes 门有许多厌氧类群或兼性厌氧类群［27］，本试验中，Firmicutes 门在正常灌溉中相对丰度显著高于干旱管理，可能是由于正常灌溉的透气性低于干旱管理，导致这些厌氧类群或兼性厌氧细菌类群相对丰度升高。

不同水分管理栽培方式对土壤理化性质有较大影响，干旱管理栽培土壤的氮、磷和有机质含量明显高于正常灌溉栽培，pH、有效钾含量显著低于正常灌溉栽培。土壤理化性质与相对丰度前十的根际土壤细菌门群落的Pearson 相关性分析表明，丰度前十的细菌门中大多与各环境因子显著相关，这与前人研究结果一致，即栽培方式的改变会导致土壤理化性质的显著改变，进而影响土壤细菌群落组成的变化［28］。特别是AN、TN 与Nitrospirota、Proteobacteria 显著正相关，说明这2 个细菌类群可能促进氮素的吸收，可能通过促进水稻根部吸收氮素来增强水稻抗逆性［29］。根据以上结果，山栏稻由干旱管理转为正常灌溉后，其与氮素吸收相关的群落Nitrospirota、Proteobacteria 丰度降低了。所以在实际生产中，山栏稻由传统旱作栽培方式转为水作栽培方式后要适当增施氮肥。

研究表明长期淹水的水生生态系统增加了细菌多样性以及物种生态网络的交互度和稳定性，增强了微生物抵抗外部环境干扰的能力，有助于维持农田生态系统功能的稳定性和可持续性［30］。本试验中不同水分管理栽培处理的相关性网络分析表明，正常灌溉栽培处理的相关性网络中的细菌属群落更多，说明正常灌溉栽培处理中更多细菌群落参与物种生态网络，这增强了农田生态系统功能的稳定性和可持续性。

4 结论

山栏稻由干旱管理转为正常灌溉，根际细菌群落组成发生了显著变化，一些与植物抗旱性相关的细菌群落如Nitrosprota、Proteobacteria 相对丰度降低；一些厌氧类群或兼性厌氧细菌类群相对丰度升高。不同水分管理栽培方式土壤理化性质差异显著，影响了土壤细菌群落组成的变化。Nitrospirota、Proteobacteria 可能通过促进水稻根部吸收氮素来增强山栏稻抗逆性。相关性网络分析表明正常灌溉处理中具有相关性的细菌属比干旱管理处理多。