γ-氨基丁酸对绵羊卵巢颗粒细胞凋亡及类固醇激素分泌的影响

单新雨 李太春 杨若晨 段香茹 康佳 张英杰 刘月琴

（河北农业大学动物科技学院，保定 071000）

γ-氨基丁酸作为一种具有4 个碳原子的非蛋白质氨基酸，广泛分布于动植物和微生物中［1］，同时，GABA 作为机体内不可或缺的一种抑制性神经递质，具有调节情绪、降低血压、调节血糖、改善肥胖、改善肝肾功能、调节免疫应答、促进胰岛素分泌、促进生殖等生理功效［2］，并对癫痫、惊厥、亨廷顿病和帕金森病等多种精神疾病具有一定的疗效作用［3-4］。此外，GABA 通过下丘脑-垂体-性腺轴系影响垂体和性腺生理机能，从而参与激素的分泌调节，影响卵巢、输卵管的功能［5-6］。GABA 目前是热门的保健品，以GABA 胶囊、GABA 茶、GABA软糖等一系列产品的形式在市面上流通，具有抗焦虑，调节血压，镇静安神，改善睡眠等功效［7-9］，在动物生产中作为添加剂可以促进采食、增强营养物质消化吸收和代谢［10-12］，并发现能够改善雌性动物繁殖性能［13］。因此，GABA 在食品保健、生物制药、饲料添加剂等领域的应用前景十分广阔，近年来有关GABA 的研究逐渐成为热点，人们对GABA 的了解也逐渐深入、清晰。

调控动物繁殖性能机制十分复杂，其中，卵泡的排卵与质量至关重要，卵泡的发育依赖于卵母细胞及GCs 间的细胞通讯［14-15］，GCs 分泌的类固醇激素可以维持卵母细胞发育成熟［16-17］，而GCs 凋亡可直接导致卵泡闭锁［18］。GABA 在30 多种外周组织中表达，包括下丘脑、垂体、子宫、卵巢、胎盘和输卵管等。研究表明，在大鼠和人的体外试验中适宜浓度的GABA 可直接作用于GCs，影响GCs类固醇激素的生成［19-22］，高浓度的GABA 可增加人黄体化GCs 凋亡［21］。不同动物生殖生理存在差异，GABA 是否对绵羊GCs 功能有调节作用未见报道。因此，本试验通过在绵羊卵巢GCs 培养体系中添加不同浓度的GABA，研究其对GCs 凋亡、类固醇激素的分泌及其相关基因表达的影响，以期揭示GABA 对绵羊繁殖机能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

从河北省保定市唐县瑞丽食品屠宰场采集体况良好的1-1.5 岁龄体重相似、饲养条件相同的性成熟健康小尾寒羊母羊新鲜卵巢，酒精及生理盐水清洗后立即放入含37℃生理盐水、1%双抗（1%青霉素、1%链霉素）的保温杯中并于2 h 内带回实验室。

1.2 方法

1.2.1 卵巢颗粒细胞培养 用75%酒精冲洗卵巢3次，37℃的生理盐水冲洗卵巢3 次，最后用含1%双抗的DMEM/F12 培养基冲洗1-2 次，放入完全培养基（10%胎牛血清（FBS）、2%双抗的DMEM/F12培养基）中，用灭菌手术刀片逐个割破直径3-7 mm的卵泡，收取卵泡液于培养基。将培养基转移到15 mL 离心管中离心（1 500 r/min，10 min）。弃去上清液，留下沉淀，加入完全培养基吹散沉淀使其均匀悬浮后离心（1 500 r/min，10 min），重复该步骤3 次。重悬浮GCs 并转移至细胞培养瓶于37℃，5% CO2的培养箱中培养，24 h 后更换培养基，去除未贴壁细胞。绵羊卵巢GCs 培养于完全培养基中，在恒温培养箱中（37℃，5% CO2）松盖培养，每1-2 d 换液一次，当细胞长至80%再消化传代。

1.2.2 GCs 免疫荧光鉴定 GCs 特异性表达促卵泡素受体（FSHR），免疫荧光法鉴定分离培养的绵羊卵巢GCs。将绵羊GCs 以1×105个/孔接种于含10% FBS、1%双抗的DMEM/F12 培养基的六孔板中，在37℃，5% CO2的培养箱中培养24 h 后吸去培养基；每孔加入4%多聚甲醛固定细胞15 min；4℃预冷多聚甲醛固定细胞20 min；0.2%的Triton X‑100室温通透细胞10 min；BSA 封闭液室温孵育30 min；加入稀释好的一抗（Rabbit Anti‑FSH receptor antibody）并放入湿盒，4℃孵育过夜；加入稀释好的 荧 光 二 抗（Mouse Anti‑rabbit IgG/Bio antibody），37℃孵育90 min；加入DAPI 染液，室温避光孵育10 min；每次操作完毕试剂反应完成后，PBS 浸洗细胞3 次；放在荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.3 颗粒细胞增殖检测 将绵羊GCs 悬液以5×103个/孔接种于96 孔板中，分为5 组，每组4个重复，添加10 μL 不同浓度的GABA，使5 个组的浓度分别为0、10-8、10-7、10-6和10-5mol/L，每孔的最终体积为100 μL，于培养箱（37℃，5% CO2）中孵育24 h；向每孔加入10 μL CCK‑8 溶液后放入培养箱中孵育3 h；15 min 内用酶标仪测定各处理组450 nm 处的吸光度。

1.2.4 颗粒细胞凋亡检测 将绵羊GCs 在六孔培养板中以105个/孔的密度培养，分为5 组，每组3 个重复，添加0、10-8、10-7、10-6和10-5mol/L GABA处理24 h，离心收集生长状态良好细胞；用1×PBS（4℃）重悬细胞一次后离心（2 000 r/min，10 min）；加入500 μL 的1×Binding Buffer 悬浮 细胞；加入5 μL 的Annexin V‑FITC 混匀后，室温避光孵育15 min；加入5 μL 的PI 染色；利用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.5 E2和P4的检测 以添加10-6mol/L GABA 为试验组，不添加GABA 为对照组，试验组和对照组GCs 在六孔培养板中以105个/孔的密度培养，每组3 个重复，细胞长至80%时收集细胞培养液，离心（3 000 r/min，10 min）取上清液，采用ELISA 试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）检测细胞培养液上清中E2和P4的浓度。

1.2.6 RT‑qPCR 检测基因表达 Trizol 法提取试验组及对照组细胞总RNA，并使用NanoDrop 2000 分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）测定浓度，反转录试剂盒将RNA 反转录成cDNA，离心管中加入1 μL cDNA，正义链和反义链引物各0.4 μL，使其工作浓度为0.2 μmol/mL，2×TransStart®Tip Green qPCR Super mix（+Dye I）10 μL，最后加入8.2 μL 灭菌水补足20 μL 体系。使用Step One Plus 仪 器（Applied Biosystems，Carlsbad，CA） 对PCNA、CCNB1、CCND1、Bax、Caspase‑3、Bcl‑2、StAR、3β-HSD、CYP11A1、CYP19A1 的 表 达量进行检测，条件为95℃预变性2 min；95℃变性5 s，60℃退火30 s，40 个循环；熔解曲线阶段95℃15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。通过熔解曲线分析验证每个PCR 扩增的特异性，以GAPDH 为内参基因，RT‑qPCR 结果采用2-ΔΔCt法进行分析。引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.7 Western blot 检测蛋白表达 样品总蛋白采用总蛋白提取试剂盒（Thermo Pierce）进行提取，然后采用BCA 定量试剂盒进行总蛋白定量。在分离胶上对总蛋白进行分离，经过转膜、封闭，然后于4℃进行一抗过夜孵育及室温进行羊抗兔二抗孵育60 min 后进行曝光及显影和定影并拍摄照片。抗体信息如表2 所示。

表2 一抗信息Table 2 Primary antibody information

1.2.8 数据统计分析 使用SPSS 26.0 软件进行统计学分析，单因素方差分析（one‑way ANOVA，LSD）用于确定多组之间的差异。两组间差异采用t 检验。显著性水平为P＜0.05 差异显著，P＞0.05 差异不显著，数据均以平均值±标准误表示。使用GraphPad Prism 进行作图。

2 结果

2.1 绵羊卵巢GCs鉴定

GCs 特异性表达FSHR 蛋白，免疫荧光鉴定结果如图1 所示。红色荧光标记的细胞即为表达FSHR阳性的细胞，蓝色荧光区域为DAPI 染液标记的细胞核，这表明分离培养的贴壁细胞为绵羊卵巢GCs。

图1 绵羊卵巢颗粒细胞鉴定（400×）Fig.1 Identification of ovine ovarian granulosa cells（400×）

2.2 GABA对绵羊卵巢GCs增殖的影响

不同浓度GABA 处理GCs 24 h 后的细胞增殖活力结果见图2。由图2 可见，添加GABA 处理组的细胞增殖活力均显著高于对照组（P＜0.05），其中，10-6mol/L GABA 处理的细胞增殖活力显著高于其他添加组（P＜0.05）。

图2 不同浓度GABA 对绵羊颗粒细胞增殖的影响Fig.2 Effects of different concentrations of GABA on proliferation in ovine granulosa cells

2.3 GABA对绵羊卵巢GCs凋亡的影响

不同浓度GABA 对GCs 凋亡影响如图3 和表3所示。添加GABA 处理组的GCs 凋亡率均显著低于对照组（P＜0.05），其中，10-6mol/L 组的凋亡率显著低于其他添加组（P＜0.05）。

图3 GABA 处理绵羊颗粒细胞凋亡结果图Fig.3 Results of apoptosis in ovine granulosa cells treated with GABA

表3 不同浓度GABA 对绵羊颗粒细胞凋亡率的影响Table 3 Effect of different concentrations of GABA on apoptosis rate in ovine granulosa cells

2.4 GABA对绵羊卵巢GCs增殖和凋亡相关基因及蛋白表达的影响

RT‑qPCR 及Western blot 检 测10-6mol/L 的GABA 处理绵羊卵巢GCs 24 h 后增殖相关基因及蛋白表达情况如图4 所示，GABA 添加组CCNB1、CCND1 和PCNA mRNA 及蛋白表达量显著增加（P＜0.05）。凋亡相关基因及蛋白表达情况如图5 所示，GABA 添 加 组Caspase‑3、Bax mRNA 及 蛋 白表达量显著降低（P＜0.05），Bcl‑2 mRNA 及蛋白表达量显著增加（P＜0.05），Bax/Bcl‑2 比值显著降低（P＜0.05）。

图4 GABA 对绵羊颗粒细胞增殖相关基因及蛋白表达的影响Fig.4 Effects of GABA on the expressions of proliferation-related genes mRNA and proteins in ovine granulosa cells

图5 GABA 对绵羊颗粒细胞凋亡相关基因及蛋白表达的影响Fig.5 Effects of GABA on the expressions of apoptosis-related genes mRNA and proteins in ovine granulosa cells

2.5 GABA对绵羊卵巢GCs E2和P4分泌的影响

10-6mol/L 的GABA 处理绵羊卵巢GCs 24 h 后，E2和P4的浓度见表4。由表4 可知，添加10-6mol/L的GABA 显著促进P4分泌（P＜0.05）且显著抑制E2分泌（P＜0.05）。

表4 10-6 mol/L GABA 对绵羊GCs 类固醇激素分泌的影响Table 4 Effects of 10-6 mol/L GABA on steroid hormone secretion of GCs in ovine granulosa cells

2.6 GABA对绵羊卵巢GCs类固醇激素合成关键基因及蛋白表达的影响

10-6mol/L GABA 处理GCs 后类固醇激素合成相关基因及蛋白的表达结果如图6 所示，与对照 组 相 比， 处 理 组StAR、3β‑HSD、CYP11A1 的mRNA 及蛋白相对表达量显著上升（P＜0.05），且试验组CYP19A1 的mRNA 及蛋白表达量显著下降（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 GABA对GCs增殖和凋亡的影响

卵巢GCs 凋亡可导致卵泡的闭锁［23］。研究表明GABA 能够有效减少活性氧（ROS）含量，从而抑制人脐静脉内皮细胞凋亡［24］。给热应激雏鸡灌服50 mg/kg BW GABA 水溶液能够减少胰腺细胞凋亡［25］。有研究发现100 μmol/L GABA 处理奶牛乳腺上皮细胞（MAC‑T）12 h 能促进脂多糖（LPS）介导的MAC‑T 细胞增殖，并可能通过PI3K/AKT 通路抑制内源性LPS 诱导的MAC‑T 细胞凋亡［26］。GABA可能通过调节蜕膜细胞和滋养层细胞的增殖，从而参与小鼠胎盘的形成过程［27］。在肺上皮细胞，GABA 通过细胞膜上的GABAA受体引起细胞膜去极化，从而使膜上电压依赖性钙通道开放，胞浆钙浓度升高，促进细胞增殖［28］。本试验研究发现，在绵羊卵巢GCs 中添加GABA 能够促进细胞增殖并抑制细胞凋亡，与前人在其他细胞类型的研究结果一致。

细胞核抗原PCNA 作为细胞增殖标志物，通过结合DNA 聚合酶促进DNA 复制，对细胞的增殖水平起正向调控［29］；而细胞周期蛋白B1（Cyclin B1，CCNB1）是有丝分裂开始的主要调节因子之一，细胞周期蛋白D1（Cyclin D1，CCND1）控制细胞周期从G1 期进入S 期［30］，是细胞增殖的重要调控因子。本研究中，GABA 处理GCs 后PCNA、CCND1、CCNB1 mRNA 及蛋白表达量显著上升，表明GABA可促进GCs 增殖。细胞凋亡与B 细胞淋巴瘤蛋白2（B cell lymphoma protein 2，Bcl‑2）和半胱天冬酶家族（Caspase）有关［31-33］，Bcl‑2 能够抑制细胞色素c 从线粒体释放，从而抑制内源性细胞凋亡［34-35］，Caspase‑3 参与了细胞最终凋亡过程［36-37］。而Bcl‑2相关X 蛋白（Bcl‑2‑associated X protein，Bax）/Bcl‑2比值作为反映细胞凋亡敏感性的分子标志物［38］，其比值上升时，Bax 容易形成同源二聚体，进而诱导细胞凋亡，而当其比值降低时，Bcl‑2 将发挥抑制细胞凋亡的功能［39］。本研究中，GABA 处理GCs 后上调Bcl‑2 mRNA 及蛋白表达，下调Bax、Caspase‑3 mRNA 及蛋白表达，且Bax/Bcl‑2 比值降低。这表明GABA 处理GCs，可抑制其凋亡。

3.2 GABA对GCs的E2和P4分泌水平的影响

GCs 可通过分泌E2和P4类固醇激素来维持卵巢正常的生理功能［40］。E2协同FSH 促进卵泡发育，诱导排卵前LH 峰的出现，促进排卵［41-42］。P4的重要作用是维持动物妊娠生理，利于胚胎着床［43］。此外，P4还能调控卵母细胞排卵及GCs 黄体化［44］。姜杰等［20,22］发现GABA 通过与其受体结合促进大鼠黄体化GCs 的P4分泌，抑制E2的生成，可能与细胞内腺苷酸环化酶系统有关。本试验结果与前人研究结果一致，GABA 促进绵羊卵巢GCs P4的分泌，抑制E2的生成。急性调节蛋白（StAR）在类固醇激素合成过程中将细胞质中的胆固醇转运到线粒体中，是类固醇激素合成的重要限速酶［45］，参与P4分泌［46］。本试验中，GABA 处理GCs 后StAR 表达显著上升，与P4分泌变化趋势一致。CYP11 编码的细胞色素P450 胆固醇侧链裂解酶（CYP11A1）是类固醇激素合成中从胆固醇到孕烯醇酮的关键酶［47-48］，3β-羟化类固醇脱氢酶（3β-HSD）催化孕烯醇酮或脱氢表雄酮生成有活性的P4和雄烯二酮，其编码基因3β-HSD 表达量与卵泡液中P4含量呈正相关［49］。本 试 验 中，经GABA 处 理 的GCs 基 因3β-HSD、CYP11A1 mRNA 及蛋白表达量上调，这与P4分泌变化趋势一致。由CYP19 编码的芳香化酶可以催化雄烯二酮及睾酮生成E2和雌酮［50-51］。本文中，GABA处理GCs 后CYP19A1 mRNA 及蛋白表达量显著下降，与E2分泌变化趋势一致。

4 结论

GABA 通 过 上 调CCNB1、CCND1、PCNA、Bcl‑2 基 因 表 达，下 调Caspase‑3、Bax 基 因 表 达，从而促进GCs 的增殖，抑制其凋亡；通过上调CYP11A1、StAR、3β-HSD 基因表达，下调CYP19A1基因表达，从而促进GCs 的P4分泌，抑制E2生成。