低共熔溶剂辅助酶法高效合成香草酸的工艺研究

许令侠 梁喆 孙建中 朱道辰

摘要：针对化学合成香草酸会造成环境污染、活性低，从植物中提取香草酸产量低、生产成本过高等问题，采用来源于Bacillus ligniniphilus L1的香草醛脱氢酶进行香草酸的生物转化。为了更好地提高酶促反应效率，在反应体系中添加适量的低共熔溶剂（DES，氯化胆碱∶1，4-丁二醇为1∶3）可以有效提升酶活并使其保持较高的稳定性。随即考察了反应温度、反应pH、反应时间和DES添加量对香草酸转化率的影响，并通过响应面实验进行工艺研究，得到最佳的转化工艺参数为反应温度36 ℃、反应pH 6.8、DES添加量17%，在此条件下香草酸的转化率达到84.57%，与未添加DES相比，转化率提升了37.98%。采用DES辅助酶法进行香草酸的生物转化，可以有效地提升香草醛脱氢酶的酶活和香草酸的转化率，制备过程绿色、安全、经济，符合香草酸绿色工业化生产的要求。

关键词：香草酸；低共熔溶剂；香草醛脱氢酶；生物转化；响应面优化

中图分类号：TS201.1      文獻标志码：A     文章编号：1000-9973（2024）02-0178-08

Study on Process of Efficient Synthesis of Vanillic Acid Using Deep Eutectic Solvent-Assisted Enzymatic Method

Abstract： In response to the issues of environmental contamination and low activity caused by chemical synthesis of vanillic acid， as well as the low yield and high production cost of extracting vanillic acid from plants， vanillin dehydrogenase derived from Bacillus ligniniphilus L1 is used for the biotransformation of vanillic acid. In order to better improve the efficiency of enzymatic catalysis reaction， adding an appropriate amount of deep eutectic solvent （DES， choline chloride∶1，4-butanediol is 1∶3） into the reaction system can effectively improve the enzyme activity and make it maintain high stability， and then the effects of reaction temperature， reaction pH， reaction time and the addition amount of DES on the conversion rate of vanillic acid are investigated. Response surface experiment is applied to study the process， and the optimal transformation process parameters are determined as follows： reaction temperature is 36 ℃， reaction pH is 6.8 and DES addition amount is 17%. Under these conditions， the conversion rate of vanillic acid reaches 84.57%， which is 37.98% higher than that of vanillic acid without adding DES. The use of DES-assisted enzymatic method for the biotransformation of vanillic acid can effectively improve the enzyme activity of vanillin dehydrogenase and the conversion rate of vanillic acid. The preparation process is green， safe and economical， which meets the requirements for green industrial production of vanillic acid.

Key words： vanillic acid； deep eutectic solvent； vanillin dehydrogenase； biotransformation； response surface optimization

香草酸，别名4-羟基-3-甲氧基苯甲酸，作为一种高档香料，在食品和化妆品领域被广泛应用，属于肉桂酸类衍生物，广泛存在于香兰豆科植物中[1]。其除了具有较高的经济价值外，还具有较广泛的医学用途，例如抗菌消炎、抗氧化、抑制酪氨酸酶活性、化感作用、调节神经和促凝血活性等作用[2-5]。目前香草酸的获得方式主要有两种：一种是工业合成香草酸，主要通过碱性条件下裂解香草醛来获得；另一种是从天然植物中进行提取。前者产量高、活性低，会给环境造成严重负担，后者产量低、活性高，但是存在植物原料严重不足的问题[6-7]。国内外对医药、食品行业原料来源以及生产过程的要求越来越严苛，例如香草酸的前体物质香草醛，只有生物来源或者通过生物途径合成的香草醛才可以被用于食品、化妆品以及药品领域[8]。生物合成香草酸的途径主要有两种：一种是以香草酸的前体物质为底物，通过微生物进行转化；另一种是通过酶催化合成[9]。由于香草酸及其前体物质多为芳香族化合物，过量的芳香族化合物会对参与转化的细胞宿主产生毒性，从而抑制香草酸的合成，在工业上很难通过微生物途径实现香草酸的大批量生产。酶催化合成香草酸具有专一性强、转化效率高、转化过程绿色清洁等优势，因此成为众多香草酸生产方式中的最佳选择之一。

低共熔溶剂（deep eutectic solvent，DES）是继离子液体（ionic liquid，IL）之后的新一代绿色溶剂，是一种由氢键供体（HBA）和氢键受体（HBD）按照特定摩尔比例和条件混合形成的均相透明液体，具有无毒、低挥发、不易燃、易保存、可定向设计等优点，被广泛应用于食品和化工领域[10-11]。关于DES的研究主要集中于植物中天然产物的分离提取以及生物质秸秆中纤维素、半纤维素、木质素的三素分离[12-15]。近年来也有研究表明DES与一些生物材料（酶、微生物细胞）表现出了较好的生物相容性，并且被证明在提升全细胞催化和酶催化效率方面具有积极意义[16-19]。例如在对黄酮苷的生物转化过程中，徐万军[20]选择DES作为酶促反应溶剂，使得β-葡萄糖苷酶活性提高，黄酮苷转化率达到96.63%。Lindberg等[21]研究发现，DES可以改变酶本身的Km值，进而影响整个酶促反应。也有研究报道DES可以提高底物和中间产物在缓冲溶液中的溶解能力，进而提升酶促反应的转化效率[22]。这预示着DES作为助溶剂或者助催剂在生物催化领域具有广阔的应用前景。

本课题组长期从事生物质资源转化及利用的研究，从南海海底泥土中筛选出1株对木质素具有高效降解能力的菌株Bacillus ligniniphilus L1，在阐明香草酸代谢途径的基础上，挖掘出香草醛向香草酸转化的关键基因，并通过基因敲除和大肠杆菌中异源表达验证了其功能[23-24]。本研究在此基础上筛选出最佳的DES，并优化反应条件，以期获得从香草醛到香草酸的最佳转化效率，为香草酸的生物催化合成提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 主要试剂

香草醛、香草酸、氯化胆碱、尿素、1，4-丁二醇、甘油、苹果酸、乳酸、蔗糖、果糖、葡萄糖：上海麦克林生化科技股份有限公司；乙腈、磷酸、IPTG、硫酸卡那霉素：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 实验菌株和培养基

所用菌株为实验室构建的香草醛脱氢酶工程菌E.coli-VDH，于－80 ℃冰箱中用甘油管保藏。LB液体培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L， pH 7.0。LB固体培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂1.6 g/L，pH 7.0。

1.1.3 实验主要溶液

考马斯亮蓝（G250）染色液：G250 37 mg，无水乙醇25 mL，磷酸50 mL，去离子水425 mL，均匀混合，于棕色瓶中保存备用。

Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）：Tris 36.3 g，用去离子水溶解，用浓盐酸调 pH 至7.4，定容至 100 mL，于棕色瓶中避光保存。

PBS缓冲溶液（pH 7.2）、0.9% NaCl溶液均于4 ℃保藏。

1.2 仪器与设备

LB-RH-250 37 ℃恒温培养箱 青岛路博建业环保科技有限公司；LC-20A高效液相色谱仪 日本岛津公司；FS-1800N超声波处理器 上海生析超声仪器有限公司；紫外可见分光光度计 伯乐生命医学产品公司；NanoDrop One蛋白浓度检测仪、MK3型酶标仪 赛默飞世尔科技公司。

1.3 实验方法

1.3.1 DES的制备

选择氯化胆碱作为氢键受体，氢键供体为苹果酸、甘油、果糖、1，4-丁二醇、蔗糖、尿素、苹果酸、乳酸、葡萄糖，按照设定的摩尔比例参考文献[14]中的方法制备DES。

1.3.2 菌株的活化与培养

从－80 ℃冰箱中取出保藏的香草醛脱氢酶工程菌E.coli-VDH，取50 μL菌液置于5 mL含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min摇床培养12 h，培养完成后在含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中划线培养，于37 ℃恒温培养箱中过夜培养，直至生长出单菌落。

挑取1环单菌落，置于5 mL含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养，按照10%接种量，置于200 mL含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中培养3～4 h，使得OD600处于0.6～0.8。加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG进行诱导，30 ℃、200 r/min摇床培养16～20 h。

1.3.3 香草醛脱氢酶的获取和纯化

将培养完成的菌株在4 ℃、6 000 r/min条件下离心10 min，离心后弃上清，加入0.9% NaCl溶液重悬，清洗2次，最后加入8 mL PBS缓冲液（pH 7.2），重悬，破碎。破碎后，于4 ℃、6 000 r/min條件下离心10 min，上清液即为获得的粗酶液。

将粗酶液采用镍亲和层析柱分离纯化香草醛脱氢酶，将纯化好的香草醛脱氢酶用 SDS-PAGE 进行分析，随即进行脱盐处理，检测最终蛋白浓度和初始酶活，最终于-20 ℃保存备用。

1.3.4 香草醛脱氢酶酶活和蛋白浓度检测

参考文献[25]中的方法，Tris-HCl（50 mmol/L，pH 7.4），不同浓度已制备的DES溶剂、组分混合溶剂（未制备DES）或单一组分溶剂，5 mmol/L香草醛、1 mmol/L NAD+，30 ℃水浴3 min，加入适量香草醛脱氢酶启动反应，反应溶液总体积为3 mL，检测5 min内溶液在340 nm波长处吸光值变化，并根据下式计算香草醛脱氢酶酶活。孵育前香草醛脱氢酶的酶活被定义为 100%。

酶活（U）=EW×V×103/（6 220×1）。

式中：EW为1 min内溶液在340 nm处吸光值变化；V为反应溶液总体积，mL；6 220为摩尔消光系数，L/（mol·cm）；1为光程距离，cm。

采用Bradford法测定香草醛脱氢酶的蛋白浓度。

1.3.5 香草酸和香草醛HPLC检测

准确配制1 mmol/L香草醛和香草酸标准溶液，溶剂选择甲醇，分别取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL香草醛和香草酸标准溶液，加入0.8，0.6，0.4，0.2，0 mL甲醇，用0.22 μm滤膜过滤，进行高效液相色谱检测，最终绘制各自的标准曲线。高效液相色谱检测条件：乙腈∶0.1%磷酸-水溶液（5∶5），流速为1.0 mL/min，检测波长为280 nm，检测温度为30 ℃。

1.3.6 香草醛脱氢酶稳定性测试

以不同pH值的Tris-HCl（50 mmol/L）缓冲溶液为基准，加入10%的DES，酶促反应pH设定为5～10，共分为6组，分别测定最终的剩余酶活。在最适pH条件下，调整反应体系的温度分别为20，30，40，50，60，70 ℃，按照同样步骤测定最终的剩余酶活。

1.3.7 单因素实验

以不同pH值的Tris-HCl（50 mmol/L）缓冲溶液为基准，准确加入1 mL香草醛脱氢酶、终浓度为1 mmol/L的NAD+和香草醛。置于水浴恒温振荡器中，转速设置为180 r/min。分别以反应温度、反应pH、DES添加量和反应时间为变量，考察各因素对香草酸转化率的影响。

1.3.8 响应面优化实验

以单因素实验结果为基础，筛选出对香草酸转化率影响显著的因素，通过Design-Expert 12.0 软件中的Box-Behnken进行实验设计和模型构建，确定香草醛转化为香草酸的最佳工艺条件。

1.3.9 香草酸转化率的测定

将反应后的溶液加热，直至蛋白变性析出，离心取0.5 mL上清液加入同等体积的甲醇溶液，用0.22 μm滤膜过滤，进样体积设置为20 μL，进行HPLC检测，将所得峰面积代入香草酸标准曲线，通过最终香草酸含量，计算香草酸转化率α：

α=C1/C2×100%。

式中：C1为香草酸浓度，mmol/L；C2为初始香草醛浓度，mmol/L。

2 结果与讨论

2.1 SDS-PAGE凝胶电泳

由图1可知，条带A为蛋白Marker，条带B为未纯化的粗酶液，条带C为纯化后的酶液。通过比对蛋白Marker，香草醛脱氢酶的分子量大约为56～58 kDa，说明蛋白在大肠杆菌中表达效果良好。纯化后的蛋白浓度为5.69 mg/mL，初始酶活为2.71 U/mg。

2.2 DES缓冲液类型的确认

在脂肪酶、纤维素酶和过氧化酶的酶促反应中，多种以氯化胆碱作为氢键受体的DES已被证实可以用于提高酶促反应[26]。因此在DES组分的筛选中，选择氯化胆碱作为氢键受体，糖基、有机酸和醇基作为氢键供体来制备不同类型的DES，不同类型DES组分配比见表1。

由图2可知，糖基作为氢键供体时，并不能提升香草醛脱氢酶的活性，果糖和蔗糖作为氢键供体时甚至表现出了一定的抑制作用，其原因可能是相较于醇基和有机酸组成的DES，糖基制备的DES通常黏度较高，阻碍了酶促反应中的传质过程，进而抑制了酶促反应的进行[27]。有机酸作为氢键供体时，虽然并没有抑制香草醛脱氢酶的活性，但是与醇基DES相比，提升效果并不明显，原因可能是有机酸基DES通常pH较低，改变了催化体系的pH值，进而不利于香草醛脱氢酶酶促反应的进行。在醇基DES中，1，4-丁二醇和甘油各自有2个和3个羟基，而尿素并无羟基结构，在形成DES的过程中，前两者形成的氢键数量多，氢键作用强，进而在提升香草醛脱氢酶酶活方面表现出了较好的效果。 通过最终的结果比较，选择氯化胆碱∶1，4-丁二醇为1∶3的摩尔比合成DES。

高效的酶促反应离不开水的参与，水对酶促反应通常表现出促进作用，而当DES作为反应溶剂时，水的添加还可以起到调节反应介质的黏度的效果。由图2可知，随着DES添加量的增加，其对酶活的提升效果呈现先上升后下降的趋势。但是DES添加量过低时，多种类型的DES表现出较低的提升效果，这意味着在酶促反应过程中，DES需有一个合适的添加量。以筛选的DES4为例，当DES添加量为5%时，酶活并未达到最佳值，10%添加量时达到最佳，但是随着添加量增加到30%，酶活反而呈现出下降趋势。形成这一现象的原因可能是DES添加量过多，黏度提高，酶促反应受到抑制；DES添加量过少，反应过程中的水分含量增加，DES中少量的氢键结构被破坏，但是对整体的氢键网络没有造成过大的影响，仍然可以提高反应的酶活[28]。因此，在后续实验中选用10%的DES添加量作为酶促反应的最佳添加量。

2.3 溶剂体系组分对香草醛脱氢酶活性的影响

为了更好地验证香草醛脱氢酶活性的增加是否與组成DES的单一组分或者混合组分有关，对以上组分进行了验证性实验。由图3可知，在添加DES组分的体系中，香草醛脱氢酶的相对酶活最高达到166%，而在单一组分和混合组分反应体系中，香草醛脱氢酶的相对酶活则表现平稳，甚至出现了略微下降的趋势。产生这一现象的原因可能是虽然选取的组分多为天然产物，但是随着含量的增多，单一组分在反应体系中不断扩散，很容易结合到酶的活性位点或者吸附在其附近，破坏分子内氢键或者阻断其与底物结合，从而影响酶的活性。与之相反，DES经过合成后，形成了强大的氢键结构，对酶的活性位点起到了保护作用。同时在一定范围内，随着DES添加量的增加，酶活也随之增加，这意味着DES对酶活的提升效果并不是由单一组分决定的，DES在反应体系中也具有较好的稳定性，并没有完成单一组分的解离[29]。

2.4 香草醛脱氢酶的稳定性

酶活是影响酶促反应进行的一个重要因素，但是酶的稳定性也是酶促进行过程中不可或缺的因素。香草醛脱氢酶的稳定性主要包括酸碱稳定性和热稳定性，因此选取溶剂体系的pH、溶剂体系的温度2个因素对香草醛脱氢酶的稳定性进行研究，并确定适合香草醛脱氢酶的反应体系。

2.4.1 pH对香草醛脱氢酶稳定性的影响

反应溶剂的pH可以改变酶的活性位点，因此酶的活性通常对反应体系pH具有较大依赖性[30]。由图4可知，香草醛脱氢酶在pH 5.0～8.0表现出了较高的稳定性，其中pH为7.0时，香草醛脱氢酶的稳定性最佳，18 h时相对酶活保持在77%，42 h后最终相对酶活仍能达到46%。这个结果可能表明香草醛脱氢酶是一种中性酶，能够在中性以及弱酸、弱碱条件下保持较高的活性和稳定性，具有广阔的工业应用前景。与之相比，在pH为9.0和pH为10.0的条件下，18 h后酶的活性基本丧失。造成这一现象的原因可能是在碱性条件下，反应体系的高pH会影响反应底物的电荷活性，酶正常的蛋白结构和形貌遭到破坏，酶的活性位点发生改变，从而阻碍了酶催化反应的进行，酶的稳定性降低[31]。

2.4.2 温度对香草醛脱氢酶稳定性的影响

由图5可知，在30 ℃以下以及60 ℃以上，大部分香草醛脱氢酶已经失去活性。在70 ℃维持18 h、20 ℃维持24 h后，酶的活性已经完全丧失。在30，40，50 ℃条件下，酶在DES体系中活性丧失不明显，42 h后仍能达到72%、77%、57%的相对酶活。由此推断香草醛脱氢酶属于中温酶，其空间结构中暴露在外的氨基酸残基多为疏水基团，疏水性的氨基酸残基可以提供更多的疏水相互作用来维持酶的结构，并最终使酶获得更高的稳定性。而另一个原因可能是DES具有强大的氢键作用，可以在酶分子周围形成保护性结构，避免酶结构遭到破坏，提高了酶的稳定性[32]。

2.5 单因素实验

上述研究已经证明低共熔溶剂可以提升香草醛脱氢酶的酶活，并且在低共熔溶剂中酶可以稳定存在，但是在实际转化过程中产物香草酸的生成仍然受多种因素的影响。香草醛脱氢酶的酶促反应需要NAD+的参与，在NAD+定量的情况下，添加过量的酶无法提升香草酸的最终产量，因此本次实验并没有考虑酶添加量对香草酸转化率的影响。最终选取了反应温度、反应pH、DES添加量、反应时间进行单因素实验，并根据单因素实验结果设计响应面优化实验，进而使得香草酸的转化率达到最高。

2.5.1 反应温度对香草酸转化率的影响

由图6可知，在选取的温度范围内，香草酸的转化率呈现先升后降的趋势，在反应温度为35 ℃时香草酸转化率最高，达到了84%。这个结果与2.4.2中的结果相对应，香草醛脱氢酶在30～40 ℃内具有较高的稳定性。当反应温度高于35 ℃时，香草酸转化率下降，这是因为温度过高影响了香草醛脱氢酶的活性，从而影响了香草酸的转化率。因此，本实验确定的最佳反应温度为35 ℃。

2.5.2 反应pH对香草酸转化率的影响

由图7可知，当pH为7时香草酸转化率最高，随着pH继续增加，香草酸转化率呈现下降趋势。这个结果与2.4.1中的结果相对应，香草醛脱氢酶在pH为7.0时具有较高的稳定性。因此，本实验确定的最佳反应pH为7.0。

2.5.3 DES添加量对香草酸转化率的影响

由图8可知，当DES添加量为15%时，香草酸转化率达到最高。当DES添加量大于15%时，香草酸转化率呈下降趋势。DES添加量过低，反应体系中的水含量较高，破坏了DES中的氢键结构，DES所提供的保护功能下降，酶活性提升不明显，转化率无法达到最大值。过高的DES添加量也会造成反应体系的黏度提升，影响产物香草酸的析出，从而使香草酸转化率降低。因此，本实验确定的最佳DES添加量为15%。

2.5.4 反应时间对香草酸转化率的影响

由图9可知，随着反应时间的延长，香草酸转化率呈上升趋势。为了更好地了解香草酸的转化趋势，选取1 mmol/L香草醛作为底物最终浓度。当反应时间在10～30 min内香草酸转化率增加较快，在30～50 min内香草酸转化率的增加变得缓慢，50 min时转化率达到最大。造成这一现象的原因可能是随着香草酸析出，酶反应的平衡受到影响，产物的增加影响了反应的进行，从而使反应效率呈现减缓的趋势。因此，本实验确定的最佳反应时间为50 min。

2.6 响应面优化实验

2.6.1 响应面模型的建立与分析

根据单因素实验结果，确定反应温度（A）、反应pH（B）和DES添加量（C）是影响从香草醛到香草酸转化效果的主要因素，Box-Behnken设计因素与水平见表2。设计三因素三水平的响应面优化实验，共17组实验，实验结果见表3。

通过Design-Expert 12软件对表3中的数据进行模拟分析，得到香草酸转化率（Y）对自变量反应温度（A）、反应pH（B）和DES添加量（C）的二次多元回归模型：Y=83.33+3.36A－0.572 5B+6.76C－4.40AB+5.56AC－0.815 0BC－14.04A2-14.06B2－10.51C2。

对上述回归模型进行方差分析，结果见表4。

由表4可知，该回归模型的P<0.000 1，模型极显著，失拟项的P>0.05，不显著，表明该回归模型具有极好的拟合性。模型的R2=0.995 8， RAdj2=0.990 5，表明该模型拟合度好，预测值与真实值偏差不大。单因素影响方面，反应温度（A）和DES添加量（C）的P值均小于0.01，表明二者对香草酸转化率的影响极显著，其中DES添加量（C）的P<0.000 1，表明其对香草酸转化率的影响效果最显著。反应pH（B）的P>0.05，表明该因素对香草酸转化率的影响不显著。因此，3个因素对香草酸转化率的影响顺序为DES添加量（C）>反应温度（A）>反应pH（B）。

2.6.2 响应面图分析与优化

各因素交互作用对香草酸转化率影响的等高线和响应面见图10，DES添加量与反应pH交互的等高线接近圆形，表明对香草酸转化率的影响相对较小；反应温度与反应pH、DES添加量与反应温度交互的等高线为椭圆形，说明對香草酸转化率的影响较大。同时也印证了2.4.1中的结果，香草醛脱氢酶在pH 5～8范围内稳定性较强，在该范围内pH的改变对酶活的影响较小，因而对香草酸转化率的影响较小。

2.6.3 工艺优化与验证

通过观察响应面曲线可以看出，香草酸转化率存在最大值，采用Design-Expert 12.0进行最终优化，得到香草酸转化率最高的反应条件：反应温度为35.94 ℃，反应pH为6.82，DES添加量为16.94%，在此条件下香草酸的转化率为84.76%。为了更好地检测结果的可信度以及考虑实际转化过程中的操作性，将最佳转化条件调整为反应温度36 ℃、反应pH 6.8、DES添加量17%，在此条件下将上述条件进行3次验证，最终得到香草酸转化率为（84.57±0.15）%。同时在此条件下将DES添加量设置为0%，得到的香草酸转化率为（61.29±0.37）%，转化率提升了约40%，更加验证了DES的添加促进了香草酸的转化。

3 结论

以氯化胆碱作为氢键受体、1，4-丁二醇作为氢键供体的DES（氯化胆碱∶1，4-丁二醇为1∶3）可以有效提升香草醛脱氢酶的酶活，并且可以使酶在反应体系内保持较高的稳定性。以此为基础构建了DES辅助酶转化香草醛生成香草酸的绿色催化工艺。以提高香草酸转化率为目标，通过单因素实验以及响应面优化实验优化转化条件，利用Box-Behnken和Design-Expert 12.0优化获得香草酸最佳转化工艺条件为反应温度36 ℃、反应pH 6.8、DES添加量17%，通过重复实验进行验证，得到香草酸最佳转化率为84.57%，与理论值相比仅差0.19%。模型的可靠性验证以及较高的香草酸转化率预测为香草酸的生物合成提供了一种新的可行性途径，为未来香草酸的大规模绿色生产提供了重要指导。

参考文献：

[1]KAUR J， GULATI M， SINGH S K， et al. Discovering multifaceted role of vanillic acid beyond flavours： nutraceutical and therapeutic potential[J].Trends in Food Science & Technology，2022，122：187-200.

[2]龚玉圆.香草酸抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性及生物被膜机制研究[D].宜昌：三峡大学，2022.

[3]ALI W I， AL-ABBASY O Y， YOUNIS S A. Vanillic acid： an antioxidant used in preventing browning process in pear （Pyrus communis L.） juice[J].Annals of the Romanian Society for Cell Biology，2021，25（3）：5272-5285.

[4]SHARMA N， KHURANA N， MUTHURAMAN A， et al. Pharmacological evaluation of vanillic acid in rotenone-induced Parkinson's disease rat model[J].European Journal of Pharmacology，2021，903（12）：174112.

[5]JUNG Y， PARK J， KIM H L， et al.Vanillic acid attenuates testosterone-induced benign prostatic hyperplasia in rats and inhibits proliferation of prostatic epithelial cells[J].Oncotarget，2017，8（50）：87194-87208.

[6]錢伟.一种香草酸连续化生产设备及生产方法：中国，CN108129298A[P].2018-06-08.

[7]LUDWIKOWSKI T M， WAGNER A O， MARGESIN R. Bioconversion of ferulic acid and vanillin to vanillic acid by cold-adapted Paraburkholderia aromaticivorans AR20-38： impact of culture conditions[J].Annals of Microbiology，2023，73（1）：1-17.

[8]KHOYRATTY S， KODJA H， VERPOORTE R. Vanilla flavor production methods： a review[J].Industrial Crops and Products，2018，125：433-442.

[9]ASHENGROPH M， NAHVI I， ZARKESH-ESFAHANI H， et al. Novel strain of Bacillus licheniformis SHL1 with potential converting ferulic acid into vanillic acid[J].Annals of Microbiology，2012，62（2）：553-558.

[10]李金涛，张明祖，何金林，等.低共熔溶剂在高分子合成中的应用[J].化学进展，2022，34（10）：2159-2172.

[11]李凌娜，杨继威，张丽芬，等.响应面法优化低共熔溶剂提取迷迭香中迷迭香酸和鼠尾草酸的工艺[J].食品工业科技，2023，44（16）：218-227.

[12]SHANG X， DOU Y， ZHANG Y， et al. Tailor-made natural deep eutectic solvents for green extraction of isoflavones from chickpea （Cicer arietinum L.） sprouts[J].Industrial Crops and Products，2019，140：111724.

[13]LIN J J， XIANG H， SUN-WATERHOUSE D X， et al. Deep eutectic solvents and alkaline extraction of protein from seabuckthorn seed meal： a comparison study[J].Food Science and Human Wellness，2022，11（4）：1028-1035.

[14]李利芬.基于氯化胆碱低共熔溶剂的木质素提取改性和降解研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2015.

[15]刘乾静，陈晓淼，王芷，等.低共熔溶剂预处理杨木水解渣拆解木质素[J].化工进展，2022，41（10）：5612-5618.

[16]仝争，王渝，何晓希，等.低共熔溶剂在生物催化中的应用研究进展[J].化学试剂，2022，44（12）：1723-1730.

[17]GORKE J， KAZLAUSKAS S R. Toward advanced ionic liquids. Polar， enzyme-friendly solvents for biocatalysis[J].Biotechnology & Bioprocess Engineering，2010，15（1）：40-53.

[18]DANESHJOU S， KHODAVERDIAN S， DABIRMANESH B， et al. Improvement of chondroitinases ABCI stability in natural deep eutectic solvents[J].Journal of Molecular Liquids，2017，227：21-25.

[19]XU P， CHENG J， LOU W Y， et al. Using deep eutectic solvents to improve the resolution of racemic 1-（4-methoxyphenyl）ethanol through Acetobacter sp. CCTCC M209061 cell-mediated asymmetric oxidation[J].RSC Advances，2014，5（9）：6357-6364.

[20]徐万军.低共熔溶剂辅助糖苷酶转化黄酮苷的研究[D].重庆：重庆大学，2019.

[21]LINDBERG D， REVENGA M D L F， WIDERSTEN M. Deep eutectic solvents （DESs） are viable cosolvents for enzyme-catalyzed epoxide hydrolysis[J].Journal of Biotechnology，2010，147（3-4）：169-171.

[22]ZHAO K H， CAI Y Z， LIN X S， et al. Enzymatic synthesis of glucose-based fatty acid esters in bisolvent systems containing ionic liquids or deep eutectic solvents[J].Molecules，2016，21（10）：1294.

[23]ZHU D， XU L， SETHUPATHY S， et al. Decoding lignin valorization pathways in the extremophilic Bacillus ligniniphilus L1 for vanillin biosynthesis[J].Green Chemistry，2021，23：9554-9570.

[24]司海兵.嗜碱耐盐菌Bacillus ligniniphilus L1解聚木质素生成香草酸的代谢途径解析[D].镇江：江苏大学，2020.

[25]张雪莹.睾丸酮丛毛单胞菌醛脱氢酶的挖掘、性质及其催化呋喃醛选择性氧化的研究[D].廣州：华南理工大学，2019.

[26]王艳玲，陈小燕，余强，等.低共熔溶剂在生物转化中的应用[J].新能源进展，2021，9（3）：211-217.

[27]YANG Z， PAN W. Ionic liquids： green solvents for nonaqueous biocatalysis[J].Enzyme & Microbial Technology，2005，37：19-28.

[28]WAITE S L， LI H， PAGE A J. NO2 solvation structure in choline chloride deep eutectic solvents-the role of the hydrogen bond donor[J].Journal of Physical Chemistry B，2018，122（15）：4336-4344.

[29]XU W J， HUANG Y K， LI F， et al. Improving β-glucosidase biocatalysis with deep eutectic solvents based on choline chloride[J].Biochemical Engineering Journal，2018，138：37-46.

[30]KOTOGN A， KECSKEMTI A， SZEKERES A， et al. Characterization of transesterification reactions by Mucoromycotina lipases in non-aqueous media[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2016，127：47-55.

[31]YANTA H， BELL E. The linkage between citrate， pH regulation and protein folding in glyoxysomal malate dehydrogenase[J].The FASEB Journal，2012，26（S1）：581.

[32]JUNEIDI I， HAYYAN M， HASHIM M A， et al. Pure and aqueous deep eutectic solvents for a lipase-catalysed hydrolysis reaction[J].Biochemical Engineering Journal，2017，117：129-138.