天然木质纤维中五碳糖转化技术

马崇敬++徐丹丹++赵晓龙++殷博++单佳玉++原韬

摘 要：天然木质纤维原料在世界范围拥有极高的产量，是转化生产天然绿色能源物质的理想底物。但木质纤维降解后成分复杂，特别是其中富含的五碳糖成分，很难被生物转化菌种充分利用，定向转化为某种单一产物。该文综述了五碳糖的来源、含量以及在生物转化过程中的利用价值，概述了能够利用五碳糖转化乙醇的微生物种类，归纳了五碳糖转化的生物学途径和改造方法，并简要介绍了由木质纤维原料降解产生五碳糖和高效利用五碳糖及五、六碳糖混合物进行转化研究方面的科技进展。

关键词：天然木质纤维 五碳糖 生物转化

中图分类号：TS262.2 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2014）06（c）-0044-01

目前，发酵法生产的燃料乙醇是公认的较为理想的清洁新能源转化方式。巴西、美国、欧盟等国家纷纷提高乙醇在燃油中的添加量，提高新的能源在燃料中的组成比例。我国同样面临能源紧缺和能源安全问题，在众多粮食作物的副产品及众多非粮作物中，富含大量的木质纤维产物，而这些木质纤维又是由五、六碳糖构成，因此，如何高效利用农副产品废料、和天然木质纤维原料降解转化生产清洁能源就成了科研工作面对的巨大挑战。

1 木质纤维和五碳糖

木质纤维是大量存在于自然界中的碳水化合物，在木质纤维作物中，纤维素的存在方式是晶体束形式，由半纤维素及木质素复形成的外壳包裹，这种外壳能够保护植物细胞[1]。目前能够人工纯培养的微生物多数能够转化产出乙醇的微生物可以高效利用六碳糖，其中葡萄糖是最容易被利用的碳源，葡萄糖首先由糖酵解途径或ED途径转化为丙酮酸，丙酮酸通过丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶转化成为乙醇。

木质纤维中的五碳糖的转化以木糖转化为主，野生型酿酒酵母无法利用木糖转化生产乙醇，因为其体内因缺少能够将木糖转化为乙醇合成关键中间产物木酮糖的酶系。因此，木糖转化为木酮糖步骤是实现木糖转化乙醇的关键环节。真菌中木糖能够在木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的催化下转化为木酮糖，细菌中木糖能够在木糖异构酶的催化下转化为木酮糖[2]。当木糖在生物体内转化为木酮糖后，木酮糖激酶将木酮糖磷酸化为5-磷酸木酮糖，经过转醛醇酶及转酮醇酶的共同作用，5-磷酸木酮糖将进而被转化为甘油醛-3-磷酸及葡萄糖-6-磷酸，然后转入磷酸戊糖途径经丙酮酸脱羧转化为乙醇[3]。

对现有菌种的改造，目前的研究主要通过两种方法实现：一种是向酵母等高效利用六碳糖的菌种中导入五碳糖代谢途径；第二种是向混合糖利用能力强，但目的产物产量低的菌种中导入增强代谢通路转化的关键基因。

2 五碳糖菌株改造方法

在这里介绍几种目前改造菌株较为常用的技术。在五碳糖转化的研究中，通常使用能够高效生产乙醇的微生物作为菌株改造的目标，包括酵母菌、运动发酵单胞菌这样的菌株，都能以六碳糖作为底物转化生产乙醇，但无法高效利用五碳糖，因此需要导入五碳糖转化通路，构建工程菌株[4]。对于能够转化混合糖的菌株，如大肠杆菌，由于缺少丙酮酸脱羧酶，且乙醇脱氢酶Ⅱ活性低，因此它们转化产出乙醇效率则相对较低。这就需要向菌株中导入增大乙醇产出代谢通路的关键酶。目前，多数以大肠杆菌为研究目标的基因工程改造工作都是以质粒作为基因载体，但质粒的遗传稳定性较差，在保藏过程中经常出现丢失等问题，不易于获得乙醇高产菌株。另外一种常用技术是原生质体融合技术，该技术通过将两个遗传性状不同的细胞融合重组产生一个新细胞，使两亲本株基因融合并产生基因重组并获得新的性状的一种技术[5]。原生质体融合技术可在不同种属间开展，通过不同的生物体细胞融合，达到改造细胞遗传性状的目的，并赋予酵母菌代谢五碳糖的能力。

3 转化产物中的数据获得方法

培养基中葡萄糖含量的测定方法较多，当以葡萄糖作为单一碳源时，发酵液中葡萄糖含量测定方法通常采用3，5-二硝基水杨酸比色法。在碱性条件下，当葡萄糖与3，5-二硝基水杨酸共热时，葡萄糖被氧化成产生糖酸等化合物，3，5-二硝基水杨酸发生还原反应，产物3-氨基-5-硝基水杨酸呈棕红色。葡萄糖的含量与产物中棕红色物质成比例关系，这时，可在520 nm波长下测棕红色物质吸光值，再根据吸光值标准曲线计算样品中葡萄糖含量。

测定发酵液中木糖含量时，同样利用3，5-二硝基水杨酸比色法。当培养基为葡萄糖与混合糖按比例配置时，可利用葡萄糖试剂盒检测混合糖发酵液中葡萄糖的含量，在采用比色法测定总还原糖吸光度值，绘制比色法的葡萄糖标准曲线，之后对发酵液中葡萄糖含量加以换算，用总还原糖吸光值减去葡萄糖的部分，就可以获得混合糖中的木糖吸光值，然后绘制的木糖的标线，计算出木糖的含量。

发酵液中目的产物含量可以通过多种方法获得，以乙醇为例，乙醇含量可以通过重铬酸钾比色法获得，也可以利用高效液相色谱和气相色谱法获得，同时，目前市场上也有多种试剂盒用来测定发酵液中的乙醇含量[6]。其中，高效液相色谱被广大科研工作者广泛认可。

4 结语

目前很多研究工作的重点为通过对五碳糖菌株的改造，以期望得到具有高效转化五碳糖途径的工程菌株。在这些研究过程中，人们往往只是通过定向基因导入，替代或敲除等技术单纯的改变细胞的某一代谢途径，而无法做到从整体上来调控细胞的代谢平衡。因此，对于目前的研究现状，还有很多工作等待着科研工作者去完成。

参考文献

[1] 许玫英，郭俊，岑英华，等.染料的生物降解研究[J].微生物学通报，2006，33（1）：138-143.

[2] 路鹏，江滔，李国学.木质纤维素乙醇发酵研究中的关键点及解决方案[J].农业工程学报，2006，22（9）：237，240.

[3] 李祖明，李鸿玉，历重先，等.纤维素酶转化木质纤维素生物质生产乙醇的研究进展[J].农业工程技术（新能源产业），2008（2）：28.

[4] 张强，冀伟，王一东.五碳糖和六碳糖共发酵生产酒精菌株选育的研究进展[J].化工进展，2013（1）.

[5] 汤斌，周逢云，张庆庆，等.Candida shehatae的纯化及其利用木糖和葡萄糖发酵的特性研究[J].食品科学，2009，30（3）：159-162.

[6] Richard AK.The next oil crisis looms large and perhaps close[J].Science，l998（8l）：l 128-113l.endprint