离子缔合褪色反应分光光度法测定甜味剂甘草酸的含量

储文 田美 黄佃宇 马卫兴

摘要：基于甘草酸二铵与三苯甲烷类阳离子染料乙基紫发生离子缔合反应，首次提出离子缔合褪色反应分光光度法间接测定甜味剂甘草酸含量的新方法。在pH 8.6的Clark-Lubs缓冲溶液中，甘草酸二铵与乙基紫发生离子缔合反应，生成的离子缔合物使溶液显著褪色，褪色的最大吸收波长在594 nm处，据此建立了间接测定甘草酸的分析方法。结果显示，甘草酸二铵的浓度在3.00～12.00 mg/L之间与吸光度差值ΔA呈良好的线性关系，相关系数为0.999 5，检出限为0.46 mg/L，表观摩尔吸光系数为3.20×104 L/（mol·cm）。方法成功用于市售凉茶样品的含量测定，加标平均回收率为97.11%～101.0%，测定值的相对标准偏差RSD为0.59%～3.23%（n=5）。该法灵敏度高、专属性强、省时简便，可用于实际样品分析。

关键词：甘草酸；乙基紫；褪色分光光度法；含量测定；离子缔合反应

中图分类号：TS202.3      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2024）02-0147-05

Determination of Sweetener Glycyrrhizic Acid Content by Ion Association Fading Reaction Spectrophotometry

Abstract： Based on the ion association reaction between diammonium glycyrrhizinate and triphenylmethane cationic dye ethyl violet， a new method for the indirect determination of sweetener glycyrrhizic acid content by ionic association fading reaction spectrophotometry is proposed for the first time. In a Clark-Lubs buffer solution with pH 8.6， there is an ionic association reaction between diammonium glycyrrhizinate and ethyl violet， and the generated ion association compounds significantly fade the solution. The maximum absorption wavelength for fading is at 594 nm， and an indirect determination method for glycyrrhetinic acid has been established based on this. The results show that the concentration of diammonium glycyrrhizinate has a good linear relationship with the absorbance difference ΔA between 3.00 mg/L and 12.00 mg/L with a correlation coefficient of 0.999 5， the detection limit of 0.46 mg/L and the apparent molar absorbance coefficient of 3.20×104 L/（mol·cm）. The method is successfully used for the determination of the content of commercially available herbal tea samples with the average spiked recovery rate of 97.11%～101.0% and the relative standard deviation （RSD） of the measured value of 0.59%～3.23% （n=5）. This method has high sensitivity， strong specificity， is time-saving and convenient， and can be used for actual sample analysis.

Key words： glycyrrhizic acid; ethyl violet; fading spectrophotometry; content determination; ion association reaction

甘草在古希臘语中被称为“甜根”，其产生甜味的主要成分是甘草酸（glycyrrhizic acid）[1]，即甘草甜素，其在植物组织中的含量在一年中的不同时间段有显著差异[2]。甘草酸是一种三萜皂苷[3]，具有护肝、抗炎、解毒、抗过敏、免疫调节等多种药理作用[4-8]。除此之外，它还是一种高甜度、低热量、安全无毒的非能量型天然甜味剂[9]，其甜度约是蔗糖的170倍[10]，可作为酱油、豆酱、腌制品、风味食品、饮料、冷冻甜食等的矫味剂[11]，使食品的口感更柔和，后味更醇香，是适合高血压、糖尿病等患者食用的最理想的甜味剂[12]。

目前测定甘草酸含量的方法主要有高效液相色谱法[13-15]、反相高效液相色谱法[16]、近红外光谱法[17-18]、高速逆流色谱法[19]、液相质谱联用法[20]等，这些方法大多需要昂贵的精密仪器且前处理方法较复杂，更加繁琐耗时。因此，开发一种简单、快速、灵敏的方法用于测定甘草酸的含量具有重要意义。可见分光光度法由于操作便捷、选择性好、测定快速而被广泛应用。由于甘草酸的铵盐即甘草酸二铵（diammonium glycyrrhizinate）的稳定性和生物活性均优于传统的甘草酸[21]，因此本研究利用甘草酸二铵与三苯甲烷类阳离子染料乙基紫（ethyl violet）在pH 8.6的Clark-Lubs缓冲溶液中发生离子缔合反应，生成的离子缔合物能使溶液显著褪色，且一定浓度范围的甘草酸二铵与体系褪色程度呈线性关系，建立了褪色分光光度法间接测定甘草酸含量的新方法，并成功将其应用于市售凉茶饮料的样品分析，相关研究尚未见文献报道。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

752N型紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；BS210S型电子天平 北京赛多利斯天平有限公司；PHS-3D型酸度计 上海高致精密仪器有限公司。

甘草酸二铵（江苏正大天晴药业股份有限公司）标准溶液：100 mg/L，称取0.100 0 g甘草酸二铵于烧杯中，用水溶解并置于1 L容量瓶中，定容摇匀，得到100 mg/L甘草酸二铵标准溶液（每1 mg甘草酸二铵折合甘草酸为0.960 3 mg）。

乙基紫（上海麦克林生化科技股份有限公司）溶液：5×10-4 mol/L，称取0.246 0 g乙基紫于烧杯中，用水溶解并置于1 L容量瓶中，定容摇匀，得到浓度为5×10-4 mol/L的乙基紫标准溶液。

Clark-Lubs缓冲溶液：pH 8.2～9.2，用浓度均为0.20 mol/L的硼酸溶液和氢氧化钠溶液按一定比例混合配制，并用酸度计校准。

所有试剂均为分析纯，试验用水为超纯水。

市售清凉茶、王老吉凉茶、凉茶。

1.2 试验方法

在10 mL具塞比色管中加入适量浓度为100 mg/L的甘草酸二铵标准溶液或测定溶液，再依次加入1.00 mL pH 8.6的Clark-Lubs缓冲溶液、0.70 mL 5×10-4 mol/L的乙基紫溶液，用水定容至刻度并摇匀，得到测定溶液A1；另配制空白溶液A0 （1.00 mL pH 8.6的Clark-Lubs缓冲溶液、0.70 mL 5×10-4 mol/L的乙基紫溶液，用水定容至刻度并摇匀）。静置10 min后将其分别置于1 cm石英比色皿中，以超纯水作参比，波长调至594 nm，测定A0和A1的吸光度，并计算吸光度差值ΔA=A0 -A1。

2 结果与分析

2.1 吸收光谱

按照1.2试验方法分别扫描500～660 nm范围内的可见吸收光谱，见图1。

由图1可知，试剂空白（曲线1）和测定溶液（曲线2）的最大吸收波长均位于580 nm处，该反应是典型的褪色反应，褪色的最大吸收波长位于594 nm处（曲线3），对比度为14 nm。在pH 8.6的Clark-Lubs缓冲介质中，甘草酸根阴离子与乙基紫阳离子依靠静电引力结合形成离子缔合物，该缔合物的形成使体系显著褪色，其本质是甘草酸二铵与乙基紫发生离子缔合反应，且甘草酸二铵在一定浓度范围内与体系褪色程度呈线性关系，故选择594 nm作为测定波长。

2.2 体系酸度的选择

试验考察了室温下594 nm处不同pH的Clark-Lubs缓冲溶液对体系ΔA的影响。准确移取1.00 mL pH 7.6～9.2范围内的Clark-Lubs缓冲溶液，按照1.2试验方法，依次对其进行吸光度测定，平行测定3次，作ΔA-pH曲线，结果见图2。

由图2可知，在pH 8.6时，ΔA最大，增大或减小pH值，ΔA均有所减小，因此选择pH 8.6的Clark-Lubs缓冲溶液进一步试验。

2.3 缓冲溶液用量的选择

试验考察了室温下594 nm处pH 8.6的Clark-Lubs缓冲溶液用量对体系ΔA的影响，准确移取0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00 mL pH 8.6的Clark-Lubs缓冲溶液，按照1.2试验方法，依次对其进行吸光度测定，结果见图3。

由图3可知，Clark-Lubs缓冲溶液用量对体系ΔA的影响不大，曲线较平稳，在0.50～3.00 mL范围内几乎不变，说明生成的产物不受缓冲溶液用量的影响，综合考虑，试验选择1.00 mL Clark-Lubs缓冲溶液作为最佳用量。

2.4 显色剂用量的选择

试验考察了室温下594 nm处乙基紫溶液用量对体系ΔA的影响。乙基紫溶液作为整个体系中最重要的反应试剂，决定着整个体系反应的进行，因此其用量对体系有着重要的影响。加入不同体积（0.20～1.10 mL）浓度为5×10-4 mol/L的乙基紫溶液，按照1.2试验方法，依次对其进行吸光度测定，结果见图4。

由图4可知，当乙基紫溶液用量为0.70 mL时，ΔA最大，增加或减少乙基紫溶液用量，ΔA均有所减小，故选择0.70 mL乙基紫溶液为最佳用量。

2.5 试剂加入顺序的选择

试验考察了室温下594 nm处1.00 mL甘草酸二铵标准溶液、0.70 mL乙基紫溶液及1.00 mL pH 8.6 Clark-Lubs緩冲溶液加入顺序不同时对体系ΔA的影响。固定其他试验条件，设计不同试剂的加入顺序，分别测定其吸光度，并计算ΔA。当加入顺序为甘草酸二铵标准溶液、Clark-Lubs缓冲溶液、乙基紫溶液时，体系的ΔA相对较大，灵敏度较高，因此本试验选用此顺序作为最佳试验顺序。

2.6 放置时间的选择

试验考察了室温下594 nm处反应时间对体系ΔA的影响，反应时间为0～60 min。通过有规律的时间间隔对测定溶液和空白溶液进行测定，作ΔA-反应时间曲线，见图5。

由图5可知，在pH 8.6 Clark-Lubs缓冲溶液中，甘草酸二铵与乙基紫的离子缔合反应十分迅速，在10 min内反应完全，ΔA最大，10 min后，ΔA有明显下降趋势，因此选择10 min进行测定。

2.7 标准曲线和检出限

依照上述选定的最佳条件，准确移取不同体积的浓度为100 mg/L的甘草酸二铵标准溶液，按照1.2试验方法，以甘草酸二铵标准溶液浓度C（mg/L）为横坐标，ΔA为纵坐标，建立标准曲线，见图6。

由图6可知，甘草酸二铵溶液浓度在3.00～12.00 mg/L范围内时与ΔA呈线性关系，线性回归方程为ΔA=0.037 3C+0.129 6，R=0.999 5，表观摩尔吸光系数为3.20×104 L/（mol·cm）。

以3倍標准偏差（s）与斜率（k）的比值计算检出限（3s/k），检出限为0.46 mg/L。

2.8 精密度试验

在10 mL具塞比色管中依次加入0.80 mL甘草酸二铵、1.00 mL pH 8.6的Clark-Lubs缓冲溶液、0.70 mL 5×10-4 mol/L的乙基紫溶液，按照1.2试验方法，对测定液的吸光度重复测试10次，以试剂空白作参比，分析结果见表1。

由表1可知，回收率在97.32%～101.7%之间，平均回收率为99.43%，相对标准偏差RSD为1.53%，具有良好的精密度。

2.9 干扰试验

室温下溶液中会存在许多共存物质，如氨基酸、降解物质、辅料等，这些物质可能会对本试验造成干扰。本试验在最佳试验条件下考察了一些常见物质对甘草酸二铵测定的影响，结果见表2。

表2 干扰试验结果

由表2可知，测定误差均在±5%以内，说明常见的干扰物质对体系基本不构成干扰。

2.10 样品分析

精密量取已知含甘草酸的清凉茶1#、王老吉凉茶2#及凉茶3#样品溶液各6 mL置于10 mL比色管中，按1.2试验方法测定吸光度，根据线性回归方程求出甘草酸二铵的含量，再进一步求出凉茶样品溶液中甘草酸的含量（每1 mg甘草酸二铵折合甘草酸为0.960 3 mg），每种凉茶样品各平行测定5份。同时加入低、中、高3个质量浓度的甘草酸二铵标准溶液，进行加标回收试验（n=5），结果见表3。

由表3可知，方法的平均加标回收率为97.11%～101.0%，相对标准偏差RSD为0.59%～3.23%，说明本方法有较高的准确度和精密度。

3 机理探究

经条件优化后，测得甘草酸二铵（分子式：C42H68N2O16）与乙基紫（分子式：C31H42N3Cl）反应的物质的量比为1∶3。在pH 8.6的Clark-Lubs缓冲溶液中，甘草酸二铵主要以甘草酸根阴离子的形式存在。1个带3个负电荷的甘草酸根阴离子与3个带正电荷的乙基紫阳离子通过静电引力结合形成离子缔合物，反应机理见图7。

由图7可知，随着甘草酸二铵浓度的增加，体系褪色愈发明显，ΔA逐渐增大，且甘草酸二铵的浓度在一定范围内与体系褪色程度呈线性关系，据此建立乙基紫可见分光光度法间接测定甘草酸的含量。

4 结论

本研究以乙基紫褪色分光光度法间接对甘草酸含量的影响因素进行考察和优化。在弱碱性环境中，甘草酸二铵与乙基紫形成离子缔合物，该离子缔合物在594 nm处产生褪色的最大吸收波长，且吸光度与甘草酸二铵的质量浓度在一定范围内呈线性关系，据此建立了间接测定甘草酸含量的新方法。该方法专属性强、准确度高、有较宽的线性范围和良好的选择性，并成功应用于市售凉茶饮料中甘草酸含量的测定，有助于生产过程中相关甜味剂的质量控制分析。

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