信阳茶树花精油的成分、抗氧化性及抑菌作用分析

向晨曦，付文军，张阳阳 ，孙鹤，赵子旭，焦豫慧

1.信阳农林学院食品科学与工程学院（信阳 464000）；2.信阳云尖茶叶有限公司（信阳 464000）

茶树花是山茶科山茶属茶树开的花，含有大量黄酮类物质及茶多酚等活性成分，具有解毒、降糖、延缓衰老、防癌抗癌、清除自由基、增强细胞活性、增强免疫力等作用[1-2]。作为一种优质的天然食品新资源，茶树花以往通常被当作农林废弃物进行处置，造成资源的大量浪费[3]。茶树花逐步受到各界广泛关注，但其开发利用依然十分有限。

植物精油是植物芳香的精华，具有独特的芳香气味。它一般可以从植物的叶、根、花、茎、果实等部位获得，成分复杂，由几十到几百种化合物组成，如醛类、酮类、酚类、酸类、萜类和芳香族化合物等，所含醛类、酚类、萜类等成分具有良好的抗氧化能力及抑菌活性。植物精油种类较多，关嘉文等[4]采用超声波辅助索式抽提法提取柚皮精油，白玉洁等[5]对杉木精油进行提取和成分鉴定，刘劲芸等[6]优化超临界CO2萃取滇红玫瑰精油的提取工艺，此外还有陈皮精油[7]、薰衣草精油[8]、金盏花精油[9]等。关于茶树花精油的研究主要集中在萃取工艺优化和不同萃取方法对比等方面，而对茶树花精油化学物质分析和生理活性功能的研究较少。

试验以信阳本地茶树花为原料，经过干燥、粉碎等预处理，运用索氏抽提的方法从信阳茶树花中提取出精油，采用气相色谱-质谱法（GC-MS）分析鉴定其化学成分进行并进一步通过试验分析茶树花精油的抗氧化能力和抑菌能力，以期为茶树花资源的开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶树花（河南茶树花农业科技有限公司茶基地）。

牛肉膏蛋白胨（YPD）、马铃薯培养基（PDA），均为上海展云化工有限公司；叔丁基对苯二酚（TBHQ，上海染料研究所有限公司）；丁基羟基茴香醚（BHA，梯希爱上海化成工业发展有限公司）；2,6-二叔丁基对甲酚（BHT，上海源叶生物科技有限公司）；ABTS自由基清除能力检测试剂盒（索莱宝生物科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计[A390，翱艺仪器（上海）有限公司]；双人单面净化工作台（SW-CJ-1C，苏州净化设备有限公司）；生化培养箱（SHP，北京中兴伟业世纪仪器有限公司）；气相色谱-质谱联用仪（7890A-7000B，美国安捷伦公司）；旋转蒸发仪（RE-52CS，上海圣科仪器设备有限公司）；万能粉碎机（FW100，无锡久平仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 茶树花精油的提取

参考刘艳霞[10]、朱贝贝[11]采用的索氏抽提法，并稍作改进。称取20 g经过干燥粉碎的茶树花粉末，用定性滤纸做成滤纸包放入提取管中，加入无水乙醇（与茶树花粉末比例11∶1），进行加热、回流提取，待回流4次后，回收提取瓶中的无水乙醇，回收结束后停止加热，冷却后倒入分液漏斗中进行萃取，待分液漏斗中的液体出现分层后收集上层较为清澈的液体，即为精油。

1.3.2 茶树花精油的成分分析

采用GC-MS对茶树花精油的成分组成进行检测分析。称取0.50 g样品于20 mL顶空瓶内，置于固相微萃取装置上，插入萃取纤维头，于50 ℃保温萃取30 min，进行GC-MS分析。GC-MS参数：采用型号DB-5MS UI型号的毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度200 ℃，不分流进样，柱箱温度50℃保持2 min，并以20 ℃/min升温至240 ℃保持2 min，选择高纯氮气为载气，载气流速1 mL/min，MS接口温度280 ℃，离子源温度230 ℃，灯丝电流35 mA，采用全扫描，扫描离子范围（m/z）20～500。

1.3.3 茶树花精油的抗氧化性分析

1.3.3.1 BHA标品、BHT标品、TBHQ标品溶液配制

分别称取100，200，300，400和500 mg各样品，在10 mL容量瓶中进行定容，同时用无水乙醇配制质量浓度10，20，30，40和50 mg/mL的茶树花精油备用。对不同质量浓度的溶液进行IC50值的测定。

1.3.3.2 总还原力测定

参照李建芳等[12]、张玉龙等[13]的方法并略加修改。取2.5 mL磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH 6.6），将2.5 mL不同稀释浓度的样品提取液加入其中，将2.5 mL铁氰化钾溶液（1%）加入将其混合均匀，于50 ℃恒温水浴中反应20 min，冷却后加入2.5 mL三氯乙酸溶液（10%）终止反应，于离心机中以4 000 r/min离心10 min。取5 mL离心后得到的上清液，与0.5 mL三氯化铁溶液（0.1%）、4 mL蒸馏水混合，静置10 min后于700 nm处测吸光度A1，测定3次平行试验。总还原力按式（1）计算。

式中：A为总还原力；A1为样品吸光度；A0为空白对照。

1.3.3.3 ABTS+自由基清除能力测定

使用试剂盒进行茶树花精油对ABTS+自由基清除能力的测定。以BHA、BHT、TBHQ作为阳性对照，将茶树花精油、BHA、BHT、TBHQ用试剂盒中的提取液配制成10，20，30，40和50 mg/mL的待测液，备用。在EP管中依次加入各试剂，制成空白管、测定管、对照管、阳性对照管，充分混匀，室温避光静置6 min。将紫外分光光度计波长设置为405 nm，分别记为A空白，A测定，A对照和A阳性对照。测定3次平行试验。ABTS+自由基清除能力按式（2）和（3）计算。

式中：DY为阳性对照的ABTS+自由基清除率，%；D为样本的ABTS+自由基清除率，%。

1.3.3.4 DPPH自由基清除能力测定

参照金玉霞[14]、Liu等[15]的方法并稍作修改。将茶树花精油用无水乙醇配成浓度不同的待测液（0，10，20，30，40和50 mg/mL），以BHA、BHT、TBHQ作为阳性对照。分别取2 mL待测液与4 mL DPPH溶液（0.1 mmol/L）混合，置于暗处反应30 min，在517 nm处测其吸光度（A1），同时将2 mL样品溶液与4 mL无水乙醇混合后进行吸光度（A2）的测定以及对4 mL DPPH溶液与2 mL无水乙醇混合后的吸光度（A0）进行测定。测定3次平行试验。DPPH自由基清除率按式（4）计算。

1.3.4 茶树花精油的抑菌试验

1.3.4.1 菌悬液的制备

取活化好的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌接种于YPD固体培养基中，酵母菌接种于PDA固体培养基中。挑取长势良好的供试菌单个菌落分别接种于50 mL无菌液体培养基中，在37 ℃恒温振荡过夜培养后将其浓度稀释至106CFU/mL，置于4 ℃备用[16]。

1.3.4.2 抑菌圈直径的测定

受试样品的制备：用无水乙醇作为溶剂配制精油样品，最终配制成50 mg/mL的样品溶液，配制浓度相同的庆大霉素溶液以无菌水（蒸馏水121 ℃灭菌20 min）为溶剂，将配制好的溶液装瓶备用。

以生理盐水为空白对照，并以庆大霉素和市面上已有的山茶花精油、薰衣草精油为阳性对照，取液体菌悬液0.2 mL在固体培养基中涂布均匀，凝固后将经过灭菌的牛津杯均匀垂直地放在每个含菌培养基的表面并于杯内加入100 μL的样品溶液，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养皿在37 ℃下培养24 h后测量抑菌圈的直径；酵母菌培养皿在37 ℃下培养72 h后测量抑菌圈的直径[17]。

1.3.4.3 最小抑菌浓度的测定

以液态营养琼脂做空白对照，将茶树花精油用无水乙醇分别配制成精油含量为5%，10%，15%，20%，25%，30%，35%和40%的溶液，取灭菌后的牛津杯垂直放置于各含菌培养皿中，并轻轻施加压力，使得牛津杯与培养基接触无空隙。在37 ℃下培养24 h后对金黄色葡萄球菌培养皿、大肠杆菌培养皿进行观察，在37 ℃下培养72 h后对酵母菌培养皿进行观察，测量各抑菌圈的大小，初次出现抑菌圈的浓度即为最小抑菌浓度。

2 结果与分析

2.1 茶树花精油挥发性组分分析

茶树花精油的挥发性组分及其相对含量见表1。根据NIST数据库对挥发性组分进行定性和半定量分析，从索氏抽提法提取的茶树花精油中共分离鉴定出18种化合物，主要包括5种醇类、3种脂肪酸类、3种烷烃类、3种酮类、2种萜烯类、1种醛类及1种酚类。鉴定成分中醇类占总含量的56.12%，占比最高；其次是脂肪酸类，占总含量的28.06%；再次是萜烯类，占总含量的12.82%。王娟等[18]采用超临界CO2、亚临界CO2和石油醚3种方法萃取茶树花精油分别得到55，50和54种挥发性成分，主要包括苯乙酮、苯乙醇、α-苯乙醇、苯甲醇和氧化芳樟醇等，与此次研究的结果有所差异，这可能是与原料品种和提取方法等因素有关。

表1 茶树花精油挥发性组分

在茶树花精油挥发性组分中，相对含量最高的3种化合物依次是苯乙醇（26.09%）、棕榈酸（17.93%）和氧化芳樟醇（13.21%）。苯乙醇多存在于玫瑰、香蕉、茉莉花等植物中，具有花香气味，有良好的抗菌效果；而相关研究也表明脂肪酸类、萜烯类和酮类等化合物具有较强的抗氧化活性[19-20]。

2.2 茶树花精油抗氧化性分析

2.2.1 总还原力

茶树花精油的总还原力与质量浓度的关系如图1所示。吸光度越大，总还原力越强，也代表其具有的抗氧化能力越强。茶树花精油的吸光度随着质量浓度的增加而增大，表明茶树花精油的抗氧化能力随着浓度增大而逐渐升高。在相同浓度下，阳性对照组TBHQ、BHT和BHA的抗氧化活性均高于茶树花精油。质量浓度50 mg/mL时，茶树花精油、BHA、BHT和TBHQ的吸光度分别为0.31，2.04，2.41和2.54。从抗氧化活性随着质量浓度变化的趋势可知，随着样品浓度增加，茶树花精油抗氧化能力增加速率显著低于阳性对照组BHA、BHT和TBHQ，其中TBHQ的总抗氧化活性最强。陈少泽等[19]研究发现蛋黄油抗氧化性与油酸等不饱和脂肪酸含量呈正相关，因此茶树花精油表现出的抗氧化能力可能是由于其组分中醇类、脂肪酸类和萜烯类化合物含量较高。

2.2.2 ABTS+自由基清除能力

由图2可知，茶树花精油对ABTS+自由基具有一定清除能力。在相同浓度下茶树花精油对ABTS+自由基清除率低于阳性对照组BHA、BHT、TBHQ，但随着茶树花精油质量浓度的增大，其对ABTS+自由基清除能力逐渐增强，二者表现出明显的量效关系。质量浓度50 mg/mL时，茶树花精油对ABTS+自由基清除率为53.18%，而在同浓度下测得的BHA、BHT、TBHQ对ABTS+自由基的清除率分别达到62.34%，67.73%和70.11%。IC50值是半抑制浓度，指自由基清除率50%时对应的质量浓度，该值越小表明其对ABTS+自由基清除能力越强[21]。茶树花精油、BHA、BHT、TBHQ对ABTS+自由基的IC50值分别为48.47，36.13，29.69和26.03 mg/mL。3组阳性对照中TBHQ对ABTS+自由基清除能力是最强的，BHA最弱。

图2 茶树花精油对ABTS+自由基的清除能力

2.2.3 DPPH自由基清除能力

DPPH是一种以氮原子为中心的比较稳定的脂溶性自由基，其氮端有单电子，醇溶液呈紫色，在517 nm处有最大吸收峰，当加入自由基清除剂与其反应后会使紫色褪去，使其在517 nm处吸收减少，因此可通过测定吸光度来评价抗氧化剂对DPPH自由基的清除能力[22]。茶树花精油对DPPH自由基的清除能力如图3所示，在10～50 mg/mL范围内，质量浓度越高，DPPH自由基清除率越大，二者呈现出较好的量效关系。阳性对照组DPPH自由基清除率要高于茶树花精油，质量浓度50 mg/mL时，茶树花精油对DPPH自由基清除率达到53.21%，而BHA可达到55%以上，且BHT和TBHQ均可达到65%以上。茶树花精油、BHA、BHT、TBHQ对DPPH自由基的IC50值分别为44.93，25.51，23.27和17.87 mg/mL。3组阳性对照中TBHQ对DPPH自由基清除能力最强，BHA最弱。植物精油中的醇类、烯萜类和酚类化合物被证明与其DPPH自由基清除能力相关，这表明茶树花精油具有一定的DPPH自由基清除活性主要与其中所含有的萜烯类和醇类物质有关[20]。

图3 茶树花精油对DPPH自由基的清除能力

2.2.4 茶树花精油的抗氧化能力对比

根据不同质量浓度下茶树花精油对ABTS+自由基清除率和DPPH自由基清除率的大小得到回归方程及IC50值。由表2可知，在试验所测的质量浓度范围内（10～50 mg/mL），茶树花精油的2种抗氧化指标的最大值分别是DPPH自由基清除率53.21%、ABTS+自由基清除率53.18%，表明茶树花精油对这2种自由基都有一定清除能力；茶树花精油对DPPH自由基的IC50值为44.93 mg/mL，ABTS+自由基的IC50值为48.47 mg/mL，比较两者的IC50值可知，其抗氧化活性大小次序为DPPH自由基＞ABTS+自由基。由此可知，茶树花精油对DPPH自由基的清除能力更强。

表2 茶树花精油的抗氧化性能力

2.3 茶树花精油的抑菌性分析

2.3.1 抑菌圈的测定结果

抑菌圈直径大小能直接反映抑菌活性的大小。由表3可以看出，茶树花精油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酵母菌都具有一定抑菌作用，尤其是对革兰阳性菌（金黄色葡萄球菌）的抑制作用最强，抑菌圈直径为15.3±0.2 mm，其次是革兰阴性菌（大肠杆菌），抑菌圈直径为13.8±0.1 mm，相比之下对真菌（酵母菌）的抑菌活性较弱。此外，茶树花精油对前2种菌种的抑菌效果明显优于阳性对照山茶花精油。由此可以判断茶树花精油具有良好的抑菌活性。

表3 茶树花精油的抑菌作用

2.3.2 最小抑菌浓度的测定结果

茶树花精油对3种供试菌的最小抑菌浓度如表4所示。最小抑菌浓度值越小表明抑菌效果越好，茶树花精油对革兰阳性菌（金黄色葡萄球菌）、革兰阴性菌（大肠杆菌）和真菌（酵母菌）的最小抑菌浓度值分别为10%，15%和30%，说明茶树花精油对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最为明显，其次是大肠肝菌，最后是酵母菌。因此，相比真菌，茶树花精油对细菌的抑制作用更强，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好。研究发现，植物精油的抑菌作用与其组分中所含物质有很大关系，如醇类、酚类和萜烯类化合物等[24]。因此茶树花精油具有较好的抑菌效果可能与其组成中所含的醇类和萜烯类化合物有关。

表4 茶树花精油的最小抑菌浓度试验结果

3 结论

经索氏抽提法提取的信阳茶树花精油通过GC-MS分析鉴定出18种化合物，以醇类、脂肪酸类和萜烯类为主，其中苯乙醇（26.09%）和棕榈酸（17.93%）相对含量较高。茶树花精油具有一定清除DPPH自由基和ABTS+自由基能力，与其质量浓度呈正相关，表现出良好的体外抗氧化活性。此外，茶树花精油还能明显抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和酵母菌的生长，尤其是对金黄色葡萄球菌，其抑制效果最佳。茶树花精油具有较好的抗氧化性和抑菌活性可能与其成分中所含的醇类、脂肪酸类和萜烯类等化合物有关，今后在开发新型香精香料、天然抗氧化剂和抑菌产品等方面具有一定应用潜力。