食品中苯甲酸和山梨酸检测方法研究进展

杨忠芳，陈玲，林青雯，张刘宁颖，林舒平，朱风鹃

海南省检验检测研究院三亚分所（三亚 572000）

食品添加剂是为改善食品品质，色、香、味，以及为防腐、保鲜和加工工艺的需要而加入食品中的人工合成或者天然物质[1-4]，已被广泛应用于工业加工食品中。苯甲酸（benzoic acid，BA）及其钠盐和山梨酸（sorbic acid，SA）及其钾盐是传统的食品添加剂，主要用于防止霉菌、真菌、酵母等微生物引起的食物腐败，苯甲酸和山梨酸通过与微生物的膜、酶、蛋白质和电子传递链相互作用而发挥抑制作用[5-7]。近年来，随着工业加工食品的发展突飞猛进，食品添加剂超标事件层出不穷。研究表明过量地摄入苯甲酸和山梨酸会引起敏感个体发生哮喘、荨麻疹和惊厥等不适反应，严重的还可导致神经系统损伤[8-10]。为规范添加剂的使用、保障食品安全，GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[3]对食品添加剂的使用原则、允许使用的食品添加剂品种、使用范围及最大使用做了规定（见表1），未规定的食品类别根据所属类别上一级规定，若无规定则为不得使用，因此对检测方法的选择和使用要求提出更高要求。随着食品的种类和加工工艺越来越丰富，食品基质种类也越来越复杂，对检测方法的要求也越来越高，鉴于此，通过对不同检测方法的综述，筛选高效、快速、准确、环境友好的苯甲酸和山梨酸检测方法，为后续食品安全监督管理提供指导。

表1 食品中苯甲酸和山梨酸允许使用的最大限量

1 苯甲酸和山梨酸的检测方法概述

国内外应用较为广泛的苯甲酸和山梨酸检测方主要有高效液相色谱法（HPLC）[11]、气相色谱法（GC）[12]、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）[13]、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）等方法。随着质谱的普及使用，相关报道呈逐年上升趋势，而分光光度法、离子色谱法和毛细管电泳法等使用不广泛，近几年的相关报道也逐渐减少。

1.1 高效液相色谱法（HPLC）

高效液相色谱法是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析[14]。同时也是国内外使用最多的分析方法，GB 5009.28—2016《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》[15]将其列为第一法，其原理为样品经水提取，高脂肪样品经正己烷脱脂、高蛋白样品经蛋白沉淀剂沉淀蛋白，采用液相色谱分离、紫外检测器或二极管阵列检测器（二极管检测器具有光谱分析功能，可用于进一步确证可疑色谱峰）检测，外标法定量。该方法以甲醇和乙酸铵溶液作为流动相，从前处理提取到上机检测操作简单，且适用于所有食品基质，该方法仅需要高效液相色谱仪便可以实现，普及率较高，但是容易出现假阳性和基质杂峰干扰，且对色谱柱的柱效要求较高，多组分测定时选择性较差，分离的时间长，难以满足大批量样品的快速检测需求。

1.2 气相色谱法（GC）

该方法是GB 5009.28—2016《食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》中的第二法，其原理为试样经盐酸酸化后，用乙醚提取苯甲酸、山梨酸，采用气相色谱-氢火焰离子化检测器进行分离测定，外标法定量。该方法仅适用于酱油、水果汁、果酱中苯甲酸、山梨酸的测定。Tungkijanansin等[16]使用固相萃取前处理样品，顶空进样-气相色谱分离测定泰国虾酱、腌菜、酱油及鱼露中的苯甲酸和山梨酸。结果显示，苯甲酸和山梨酸在5～150 mg/L的浓度范围具有良好线性关系，回收率83%～109%，精密度4.5%～6.0%。何亚芬等[17]采用优化后的气相色谱条件，筛选前处理使用的沉淀剂选择和用量，选择2.5 mL亚铁氰化钾溶液与乙酸锌溶液为沉淀剂；优化甜蜜素的衍生条件，确定使用5.0 mL 200 g/L硫酸浓度，5.0 mL 50 g/L亚硝酸钠浓度，酸反应温度25 ℃，冰浴衍生时间30 min处理。筛选气相色谱柱，选用HP-5（30 m×0.35 mm，0.25 μm），气相色谱进样口温度220 ℃，检测器温度260 ℃。柱温程序：升温70 ℃（3 min）→30 ℃/min→190 ℃（2 min）→30 ℃/min→250 ℃（4 min）。按上述条件进行检测，经氢火焰光度检测器同时测定桃酥、月饼、葵花籽、果酱、酱油、醋等样品中的山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸酯类、丙酸和甜蜜素，检测结果回收率高、精密度较好、快速便捷、操作方便，还扩展了桃酥、月饼、葵花籽等食品基质，简化操作流程，节约人力物力。相比于GB 5009.28—2016的第二法，该方法减少乙醚等易挥发、管制试剂的使用，检测方法渐渐地趋向环境友好方向发展。

1.3 高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）

该方法是在液相色谱作为分离的基础上，以质谱作为检测器进行分析的方法，由于质谱具有高分辨、高灵敏度、高选择性特点，逐渐成为微量、痕量分析的首选方法。近几年，质谱的普及率虽然越来越高，但高效液相色谱-串联质谱法测定苯甲酸和山梨酸的相关的研究也不多。我国现有的标准方法SN/T 2012—2019《出口食醋中苯甲酸、山梨酸的检测方法 液相色谱及液相色谱-质谱质谱法》[18]也仅适用于食用醋的检测。丘保福等[19]建立液质联用法同时测定植物饮料凉茶、冬瓜茶、菊花茶中的3种防腐剂（苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸）和4种甜味剂（安赛蜜、甜蜜素、糖精钠、阿斯巴甜），以10 mmol/L乙酸铵和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，在电喷雾负离子模式（ESI-）下，用多重反应监测模式（MRM）进行检测，该方法前处理简单，灵敏度高。陈燕等[20]建立食品中30种食品添加剂同时检测的超高效液相色谱-串联质谱法，经甲醇-乙腈-水（1∶1∶1，V/V）溶液提取，离心，采用超高效液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。对白酒、番茄酱、葡萄干和鱿鱼干4种基质作加标回收测定，回收率为60%～120%，相对标准偏差均＜10%。综上所述，多食品类别中的苯甲酸、山梨酸高效液相色谱-串联质谱法测定或将成为新的研究方向。

1.4 气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）

气相色谱-串联质谱法是样品经提取后、净化后，注入气相色谱进行分离，分离的化合物进入质谱，以质谱作为检测器对目标物进行定量和定性分析的方法。该方法具有分析速度快、分离效率高、灵敏度高、专一性强等特点而成为研究关注的热点。近年来，Wang等[21]采用气相色谱-质谱法同时测定糕点中12种防腐剂，方法经优化后采用乙腈提取，D4-羟基苯甲酸乙酯为内标经正己烷脱脂、饱和氯化钠溶液除杂，涡旋，离心，氮吹浓缩至近干，甲醇复溶，上机分析。苯甲酸和山梨酸在2.5～50 μg/mL的浓度范围内具有良好的线性关系，在低、中、高3个水平的加标回收率为80.73%～90.26%。李燕等[22]采用气相色谱-串联质谱法快速测定酱油、牛奶、饮料、黄酒、啤酒、蜂蜜6类食品中3种糠醛和5种防腐剂（苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯），样品采用10.0 mL乙腈提取（饮料、黄酒、啤酒、蜂蜜样品加无水硫酸镁振荡提取，酱油、牛奶等复杂基质需加入C18、PSA进一步净化），离心过滤便可上机测定。离心过滤膜后上机检测。Ding等[23]首次提出液-液分散微萃取（DLLME）-GC-MS方法测定食品中的7种防腐剂，方法中采用0.5 mL丙酮和0.05 mL三氯甲烷作为提取液，温和振摇提取后，经离心，三氯甲烷成小液滴聚集在离心管底部，取有机物注入GC-MS分析。该方法提取时间仅需1 min，使用有机溶剂只有0.55 mL，不仅快速，且有机溶剂的使用量较少，对环境比较友好，这或将成为一个新发展趋势。

1.5 分光光度法

分光光度法利用目标物在特定波长的吸光度与其浓度呈比例的特点，建立回归曲线来测定样品中的目标物浓度。白海鑫等[24]基于吸光度的加和性原理，在选定波长254和224 nm下，通过对苯甲酸/山梨酸的吸光度与浓度间的标准曲线进行线性回归分析所得的斜率，建立了苯甲酸和山梨酸吸光度与浓度的关系方程组，获得一种无需分离即可同时测定食品中的苯甲酸和山梨酸含量的方法。Danchana等[25]提出利用winR程序进行多元线性回归处理数据，来测定果汁、酱油、软饮料中的苯甲酸和山梨酸。分光光度法仅需要一台分光光度计便可以测定，设备成本低，且操作简单、快速，但由于其干扰大，该法的使用和研究报道并不多。

1.6 离子色谱法

离子色谱法也是高效液相色谱的一种，主要是利用离子之间对离子交换树脂的亲和力差异而进行分离。且苯甲酸和山梨酸在碱性环境下呈阴离子状态，因此能通过离子色谱仪的电导检测器测定。近年来，许晶冰等[26]采用离子色谱法测定肉制品中亚硝酸盐、硝酸盐、山梨酸、苯甲酸、安赛蜜5种食品添加剂。郑晶晶等[27]采用离子色谱法测定酱腌菜中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、糖精钠、安赛蜜和甜蜜素6种食品添加剂。研究均采用20 mmol/L NaOH溶液提取，基质复杂的还需经过C18、Ag固相萃取小柱净化后，以氢氧根为淋洗液洗脱，采用电导检测器检测。与传统液相色谱法相比，离子色谱灵敏度高、操作简单、使用有机溶剂少，是一种非常环保的检测方法。但同时也具备传统液相色谱法的缺点，食品基质复杂，对前处理净化要求高，净化不好则容易受到未知峰的干扰。

1.7 毛细管电泳法（CE）

毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）法是以石英毛细管为分离通道，高压直流电场为驱动力的分离检测技术[28]。张礼春等[29-30]采用毛细管电泳法测定饮料中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯7种防腐剂。采用胶束电动毛细管电泳法快速测定调味品中山梨酸和苯甲酸，采用70 mmol/L的硼砂盐缓冲液体系（pH 8.3）为电解质溶液，分离电压14 kV，柱温25 ℃，于214 nm波长处进行紫外检测，样品中山梨酸和苯甲酸在30 min内即可达到完全分离。该法相比于气相法和高效液相法具有样品预处理简单、分离效率高、试剂消耗量少、成本低等优点，高效毛细管电泳较为娇气，稍有些改变，对样品测量重现性影响较大。

2 结语和展望

食品安全关系到人民的身体健康，一直都是人们高度关注的焦点问题，同时也是食品安全监管工作中的一个重要环节。食品添加剂超范围使用的问题依旧严峻，近年来，国家监管部门对苯甲酸、山梨酸等添加剂的使用的监管力度不断加强，抽检数量、食品种类不断增加，这对检验检测技术提出新的挑战。GB 5009.28—2016《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》中的高效液相色谱法是监管配套的推荐方法，也是使用最为广泛的方法。但随着监管力度加大，任务增加，该方法分离的时间长，多组分测定时选择性较差，易出现假阳性；抽检的食品种类多，基质复杂，易受到基质杂峰干扰，已难以满足大批量样品的快速检测需求。而高通量、快速检测、定性准确、灵敏度高的方法如高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）虽有相关研究，但未有相关标准方法的发布，以补充苯甲酸、山梨酸检测。所以未来质谱方法的深入研究以及相关标准方法的建立是一个很好方向，为食品安全监管需求提供强有力的支撑。