黑蒜桑葚复合口服液工艺优化及其抗氧化活性研究

怀欲晓，李文璇，邢佳琦，唐百川，卢晓明,2

1.山东农业大学 食品科学与工程学院（泰安 271018）；2.山东省高等学校食品营养与健康重点实验室（泰安 271018）

黑蒜是大蒜经高温、高湿处理一定时间后得到的产品，具有独特的口感，无辛辣刺激味道，口感软糯酸甜，深受人们喜欢[1]。与新鲜大蒜相比，发酵后的黑蒜多酚、多糖含量及抗氧化能力均较高[2]，富含没食子酸、p-香豆酸、槲皮素、儿茶素及表儿茶素等多酚类化合物[3]，具有较高的铁离子还原能力、清除DPPH·、ABTS+、OH和超氧阴离子自由基的抗氧化活性[4-5]，以及抗炎、抗癌及预防肥胖等多种生理活性[6]，已经成为公认的天然保健食品，开发和应用前景十分广阔[7-13]。

黑桑葚又称为桑枣、桑果、桑椹，色泽诱人，酸甜多汁，风味较独特[14]。桑葚中除了含有机酸、维生素、氨基酸等营养物质外[15-16]，还富含酚类和花色苷等多种功能成分[17]。研究表明，桑葚能有效地清除自由基[18]，具有抗肿瘤[19]、降血糖[20]、降血脂[21]等多种功能。目前，桑葚因其良好的口感、丰富的营养物质和对人体的健康功效使得其精深加工产品的市场需求量激增，备受关注。

此研究以黑蒜和桑葚为原料，羧甲基纤维素钠为稳定剂，通过添加一定量的赤藓糖醇、薄荷醇和柠檬酸进行调味制得黑蒜桑葚复合口服液，并与抗坏血酸进行对比，以DPPH自由基、羟自由基、ABTS+自由基清除能力等指标评价其抗氧化活性[22-23]，以期为黑蒜桑葚复合口服液的开发提供理论依据和技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

独头黑蒜（济南康泽生物科技有限公司）；桑葚（泰安农贸市场）。

1.2 试剂

没食子酸（分析纯，天津市百世化工有限公司）；福林酚（分析纯，北京索莱宝科技有限公司）；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（分析纯，梯希爱化成工业发展有限公司）；过硫酸钾、水杨酸、硫酸亚铁、无水乙醇、碳酸钠、H2O2溶液（分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司）；抗坏血酸（分析纯，天津市风船化学试剂材料科技有限公司）；赤藓糖醇、薄荷醇、柠檬酸（食品级，河南万邦实业有限公司）；羧甲基纤维素钠（食品级，亿鑫生物科技有限公司）。

1.3 主要仪器与设备

HH-S4数显恒温水浴锅（江苏金怡仪器科技有限公司）；离心机（上海安亭科学仪器厂）；FSJ-A03D1粉碎机（小熊电器股份有限公司）；CN-LPC6002电子秤（昆山优科维特电子科技有限公司）；Lambda 365紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）；pH计（奥豪斯仪器有限公司）；PAL-1糖度计（ATAGO）。

1.4 试验方法

1.4.1 黑蒜桑葚复合口服液的制备

流程图如图1所示。

图1 黑蒜桑葚复合口服液流程图

1.4.2 原料处理

黑蒜汁制备：黑蒜去皮清洗，按照1∶6（g/mL）的比例与水混合破碎，在60 ℃水浴浸提20 min，冷却后过滤，在4 000 r/min下离心10 min，取上清液。

桑葚汁制备：桑葚用5%的食盐溶液浸泡清洗5 min，按照1∶3（g/mL）的比例与水混合进行榨汁并过滤，在4 000 r/min下离心10 min，取上清液。

1.4.3 复合口服液工艺条件的确定

1.4.3.1 单因素试验

根据预试验结果，确定黑蒜汁与桑葚汁比例3∶5、羧甲基纤维素钠添加量0.60%。以预试验为基础，优化赤藓糖醇添加量、薄荷醇添加量和柠檬酸添加量的最佳配比。

因素设计：赤藓糖醇添加量分别为1.00%，1.50%，2.00%，2.50%和3.00%；薄荷醇添加量分别为0.25%，0.50%，0.75%，1.00%和1.25%；柠檬酸添加量分别为0.40%，0.50%，0.60%，0.70%和0.80%。考察以上3个因素对桑葚黑蒜复合口服液工艺的影响，并结合感官评分确定单因素的最佳条件。

1.4.3.2 响应面优化试验设计

在单因素试验基础上，通过Design-Expert软件，以模糊感官评分为响应值，设计三因素三水平响应面试验，得到复合口服液的最优工艺条件。因素与水平见表1。

表1 响应面试验设计因素与水平 单位：%

1.4.4 感官评价标准

黑蒜桑葚复合口服液的评价采用感官综合评分法，参照GB 7101—2022《食品安全国家标准饮料》[24]进行评价，制定出评价标准。由10同学组成感官品评小组，主要对复合口服液的组织状态、滋味、气味和口感4个方面进行评定。评定每一个样品后，清水漱口评定下一个样品。评价标准如表2所示。

表2 黑蒜桑葚复合口服液感官评价标准

1.4.5 模糊数学评价模型的建立

1.4.5.1 因素集的建立

以组织状态、滋味、气味和口感组成评价因素集，即U={组织状态，滋味，气味，口感}。

1.4.5.2 评语集的建立

以优（V1）、良（V2）、中（V3）、差（V4）组成每个因素的评语集，即V={优，良，中，差}。

1.4.5.3 评价权重集的确定

将评价因素组织状态、滋味、气味和口感分别赋予权重系数0.20，0.25，0.25和0.30，即W={0.20，0.25，0.25，0.30}。

1.4.5.4 模糊关系综合评判集的确定

参考李梦倩等[25]方法，采用模糊数学评价法对黑蒜桑葚复合口服液感官综合评价进行评定。对10名感官评价人员模糊数学评价各因素投票数统计，每组样品的评价结果L=（权重矩阵M×模糊矩阵T），得到模糊评价矩阵T1～T17。分别赋予优、良、中、差分值为90，80，70和60分，将L中的各个量分别与相应分值相乘再相加即可得感官评分。

1.4.6 理化指标的测定

1.4.6.1 pH测定

采用pH计测定pH。

1.4.6.2 可溶性固形物含量测定

采用糖度计测定可溶性固形物含量。

1.4.6.3 总酚含量测定

总酚含量采用Folin-Ciocalteu法[26-27]测定。以含量（μg）对吸光度进行线性回归，得回归方程y=0.028 7x+0.020 5，线性关系R2=0.999 2，线性范围10～60 μg。结果以没食子酸当量（gallic acid equivalents，GAE）表示，单位μg GAE/mL。

1.4.7 抗氧化活性研究

1.4.7.1 DPPH自由基清除率的测定

取2 mL复合口服液于10 mL离心管中，与2 mL DPPH溶液混匀，避光放置30 min后，以乙醇为空白对照，于波长517 nm下测定吸光度A1；同时测定2 mL复合口服液与2 mL无水乙醇混合后的吸光度A2，及2 mL无水乙醇与2 mL DPPH溶液混合后的吸光度A0；以VC作为阳性对照。DPPH自由基清除率按式（1）计算。

式中：A1为波长517 nm下测定的吸光度，L/（g·cm）；A2为2 mL复合口服液与2 mL无水乙醇混合后的吸光度，L/（g·cm）；A0为2 mL无水乙醇与2 mL DPPH溶液混合后的吸光度，L/（g·cm）。

1.4.7.2 羟自由基清除率的测定

加入1 mL FeSO4溶液和1 mL H2O2溶液于10 mL离心管中混匀，依次加入1 mL乙醇-水杨酸溶、1 mL复合口服液及1 mL去离子水，混匀后于37 ℃水浴避光放置15 min后，于波长510 nm处测定吸光度A1。同样方法测定以1 mL去离子水代替H2O2溶液的吸光度A2，及以1 mL去离子水代替待测液的吸光度A0。其中，A0以不加H2O2体系为参比，A1和A2以纯水为参比，VC作为阳性对照。按式（2）计算羟自由基清除率[28-29]。

式中：A1为波长510 nm下测定的吸光度，L/（g·cm）；A2为以1 mL去离子水代替H2O2溶液的吸光度，L/（g·cm）；A0为以1 mL去离子水代替待测液的吸光度，L/（g·cm）。

1.4.7.3 ABTS+自由基清除率的测定

取4.8 mL ABTS+自由基稀释液，加入0.2 mL复合口服液并混匀，室温下避光反应15 min，以无水乙醇为参比，于波长734 nm处测定吸光度A1。以0.2 mL无水乙醇代替待测液作空白对照，测定吸光度A0，VC阳性对照。ABTS+清除率按式（3）计算。

式中：A1为波长734 nm下测定的吸光度，L/（g·cm）；A0为0.2 mL无水乙醇代替待测液作空白对照测定的吸光度，L/（g·cm）。

1.4.8 数据统计

每组试验平行测定3次，采用Design-Expert 11.0和IBM SPSS 27处理分析试验数据，0rigin 8.0作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 赤藓糖醇添加量的确定

从图2可以发现，赤藓糖醇添加量为1.00%～2.00%时，感官评分逐渐升高，高于2.00%时感官评分呈现降低趋势。当赤藓糖醇添加量＜2.00%时，口服液甜度不足，添加量＞2.00%时口服液过于甜腻，掩盖了其本身原材料的滋味。在赤藓糖醇添加量为2.00%时，感官评分最高，甜度适口，风味独特，因此赤藓糖醇添加量选择2.00%。

图2 赤藓糖醇添加量对口服液的感官评分的影响

2.1.2 薄荷醇添加量的确定

从图3可以看出，薄荷醇添加量为0.10%～0.15%时，感官评分逐渐上升，0.15%以上感官评分逐渐降低。当薄荷醇添加量＜0.15%时，感官评分稍低，添加量＞0.15%时具有较强的薄荷清凉感，产生苦涩味，掩盖了桑葚黑蒜原有的风味，因此薄荷醇添加量选择0.15%。

图3 薄荷醇添加量对感官评分的影响

2.1.3 柠檬酸添加量的确定

从图4可以看出，随着柠檬酸添加量的增加，感官评分呈现先逐渐升高后降低的趋势。当添加量为0.60%时，感官评分最高。当柠檬酸添加量＜0.60%时，饮料酸味不足，不够爽口；添加量＞0.60%酸味过重。因此柠檬酸添加量选择0.60%。

图4 柠檬酸添加量对感官评分的影响

2.2 响应面试验结果分析

2.2.1 响应面设计及方差分析

选择赤藓糖醇添加量（A）、薄荷醇添加量（B）和柠檬酸添加量（C）为自变量，感官评价（Y）为因变量进行响应面试验。响应面试验结果如表3所示，方差分析结果如表4所示。

表3 响应面试验设计与结果

表4 回归系数方差分析结果

利用Design-Expert 11.0软件对表3中的试验数据进行分析，得到二次多项回归方程：感官评分=88.83+0.273 7A+2.05B-2.92C-0.462 5AB-0.350 0AC+0.662 5BC-2.50A2-3.66B2-4.582C2。

由表4可知，感官评分模型F值=264.76，P＜0.000 1，表明该试验所用数学模型极显著，具有统计学意义，失拟项为0.247 2（P＞0.05），为不显著，表明模型的预测结果良好，预测值与实际值接近，可用于预测黑蒜桑葚复合口服液的最佳配方。回归方程的预测值之间的相关系数模型的R2=0.997 1，Radj2=0.993 3，表明试验数据可用模型进行相关解释，方程的可靠性较高。变异系数（C.V.）为0.994 9%，较小，方程模型具有良好的拟合性。一次项B、C及二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），根据F值可知，各因素对试验结果影响的先后顺序为B＞C＞A，即薄荷醇添加量＞柠檬酸添加量＞赤藓糖醇添加量。

2.2.2 各因素的交互作用分析

响应面反映了各因素之间交互作用的强弱，响应面倾斜度越高，表明各因素之间的交互作用越显著[30]。从图5可以看出，赤藓糖醇添加量、薄荷醇添加量、柠檬酸添加量的交互作用对复合口服液感官评分影响的响应面坡度均相对陡峭，表明赤藓糖醇添加量、薄荷醇添加量、柠檬酸添加量之间的交互作用对感官评分均有影响，且薄荷醇添加量和柠檬酸添加量的交互作用坡度倾斜度较高，交互作用较大。响应面图中的最高点存在响应值极值，表明黑蒜桑葚复合口服液的感官评分具有极大值。

图5 两因素交互作用对黑蒜桑葚复合口服液感官评分影响的响应面

为进一步确定最佳工艺条件，结合各因素间交互作用对感官评分的影响并以最高感官评分为优化目标，根据Design-Expert 11.0软件运行结果，得到最佳工艺条件：赤藓糖醇添加量1.98%，薄荷醇添加量0.14%，柠檬酸添加量0.61%，在此条件下模型预测感官评分为88.85分。

2.3 黑蒜桑葚复合口服液最佳配方验证

为了便于操作，在黑蒜汁和桑葚汁比例3∶5、羧甲基纤维素钠添加量0.60%的条件下，选择赤藓糖醇添加量2.00%、薄荷醇添加量0.15%、柠檬酸添加量0.60%进行3次重复试验验证，平均感官评分为88.24±0.35，与模型预测结果88.85接近，表明该模型与实际试验结果拟合度较好，具有一定可行性。

2.4 理化指标测定结果

测定最佳工艺条件下获得的黑蒜桑葚复合口服液的理化指标，结果显示可溶性固形物含量10.00%，pH 3.12，总酚含量17.83 μg GAE/mL。

2.5 抗氧化活性研究与分析

如表5所示，与抗坏血酸相比，复合口服液DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率、ATBS+自由基清除率略低，分别为90.05%，57.14%和87.64%，表明该口服液具有一定的抗氧化效果。

表5 黑蒜桑葚复合口服液抗氧化活性成分和自由基清除能力检测结果 单位：%

3 结论

此试验以黑蒜和桑葚为主要原料，在单因素试验的基础上，采用模糊数学综合评价法结合响应面试验优化法获得黑蒜桑葚复合口服液的最佳工艺条件。最佳工艺条件为黑蒜汁和桑葚汁比例3∶5，羧甲基纤维素钠添加量0.60%，赤藓糖醇添加量2.00%，薄荷醇添加量0.15%，柠檬酸添加量为0.60%。在最佳工艺条件下，感官评分为88.24分，产品pH为3.12，可溶性固形物含量为10.00%，总酚含量为17.83 μg GAE/mL，DPPH自由基清除率为90.05%，羟自由基清除率为57.14%，ATBS+自由基清除率为87.64%。黑蒜桑葚复合口服液色泽均匀，呈深紫红色，澄清透明，无分层现象，酸甜爽口，具有独特的黑蒜和桑葚风味和较高的抗氧化活性。此研究为黑蒜和桑葚多元化产品的研发提供了理论依据。