褪黑素对鲜切马铃薯过冷贮藏期间褐变的影响

刘岳，李学进，王晓冉，马笑巍，王晓东，姜瑜倩，李喜宏*，杨相政

（1.天津科技大学 食品科学与工程学院，天津 300457；2.浙江大学 农业与生物技术学院，浙江 杭州 310058；3.中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东 济南 250200）

近年来，全球经济发展促进了人们对方便食品的需求，因而鲜切果蔬受到了广泛的关注[1]。马铃薯作为最重要的农产品，含有丰富的碳水化合物、蛋白质、维生素C、微量元素和氨基酸[2]，常被用于餐饮业。然而，鲜切马铃薯在制备过程中的机械损伤会导致其在贮藏过程中的品质恶化，其中褐变是鲜切马铃薯品质恶化的主要原因[3]。褐变会导致其颜色和光泽度、口感、气味甚至硬度等品质恶化。因此，在保持新鲜马铃薯风味和延长保质期的同时防止褐变是很重要的。

褪黑素（melatonin treatment，MT）是一种多效性分子，在生物体中具有许多不同的作用[4]。在植物中，褪黑素被当作种子萌发、根系增殖、开花、坐果和果实成熟的植物生长调节剂[5-7]。此外，褪黑素可以延长保质期并保持采后水果的品质[8-9]。过冷（supercooled，SC）贮藏是指存储温度降至冰点以下但不结冰的贮藏方法[10]。据报道，SC 贮藏可将大蒜、青葱、鲜切苹果和鲜切卷心菜的保质期延长1.0～2.5 倍[11-12]。鲜切马铃薯的SC 贮藏是可行的，因为它可以降低酶活性[13]。但过冷的环境会刺激膜脂质相关的酶活性，产生更多的丙二醛（malondialdehyde，MDA），并加速储存过程中的褐变[14]。然而褪黑素除了影响这些正常的生理功能外，还具有抗氧化剂的功能，可以抑制酚类化合物的氧化并在清除活性氮和活性氧方面具有重要作用[15]。它通过调节抗氧化酶活性来维持活性氧（reactive oxygen species，ROS）代谢的平衡，从而减少膜脂质氧化，提高果蔬对冷胁迫的耐受性[16-17]。

褪黑素处理结合过冷贮藏有望对鲜切马铃薯的品质维持起到协同作用。因此，本研究对褪黑素处理过的鲜切马铃薯在8 d 过冷贮藏期间的理化变化和质量评价进行观察和分析。具体研究SC 贮藏前褪黑素处理对鲜切马铃薯的抗褐变和抗冷害的影响，利用酶活性比，探究褪黑素处理是否可以抵消SC 对鲜切马铃薯的冷损伤，提高鲜切马铃薯的品质变质抵抗力，延长鲜切马铃薯的货架期。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

马铃薯：市售；聚乙烯吡咯烷酮、β-巯基乙醇、L-苯丙氨酸、邻苯二酚、三氯乙酸、乙二胺四乙酸、愈创木酚、硫代巴比妥酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical ，DPPH）、无水乙醇（均为分析纯）、褪黑素（食品级）：天津百奥泰科技发展有限公司；过氧化氢试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；超氧阴离子检测试剂盒：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

冰箱（BC-142FQD）：TCL 科技集团股份有限公司；温度记录仪（FLUKE2638A）：美国福禄克电子仪器公司；超声仪（SB-6000DT）、真空干燥机（SCIENTZ-12N/A型）、精密色差仪（WR-18）：宁波新芝生物科技股份有限公司；摇床（HY-60）：武汉汇成生物科技有限公司；离心机（TGL-16）：四川舒科仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 冰点和过冷点的测定

鲜切马铃薯的初始冰点和过冷点的测定参考Koide等[18]的方法并稍加修改。将T 型热电偶固定在每个马铃薯样品（2 cm×2 cm×2 cm）的几何中心，后将其放入聚丙烯盒后，置于-40 ℃冰箱中。采用温度记录仪以3 s 的间隔记录温度，直到样品冷却至-20 ℃。建立鲜切马铃薯的时间温度曲线（n=10）用于确定冰点和过冷点。

1.3.2 样品处理

选择大小均匀、成熟度相同的马铃薯清洗后，用已杀菌的去皮器和切片器将马铃薯去皮并切成厚度约4 mm 的马铃薯鲜切片，根据预试验所得结论，将马铃薯鲜切片用浓度为250 μmol/L 的MT 溶液浸泡15 min，另取一组用蒸馏水浸泡15 min 作为对照。将处理过的马铃薯鲜切片晾干表面水分后放入食品自封袋（聚乙烯材质，厚度0.7 mm），分别置于-2 ℃（SC 贮藏）和4 ℃条件下贮藏8 d，分别在第0、2、4、6、8 天评价分析3 组样品：1）对照组（CK 组，4 ℃）；2）过冷贮藏组（SC 组，-2 ℃）；3）褪黑素+过冷贮藏组（MT+SC 组，250 μmol/L MT，-2 ℃）。

1.3.3 褐变指数测定

马铃薯鲜切片表面颜色采用便携式精密色差仪进行测定，根据以下公式计算褐变指数（browning index，BI）。

式中：B为褐变指数；L*为亮度值；a*为红绿值；b*为黄蓝值。

1.3.4 丙二醛含量的测定

参考Li 等[19]的方法测定MDA 含量。

1.3.5 抗氧化能力测定

马铃薯中的酚类物质提取参考Tang 等[20]的方法并稍加修改。将冷冻马铃薯样品在真空干燥机冻干24 h，然后磨成粉末。将马铃薯干粉（1 g）和含有体积分数0.1% 冰醋酸（5 mL）的70% 甲醇混合均匀，室温下用摇床以400 r/min 避光提取2 h，然后175 W 超声处理30 min。将混合物用离心机以10 000×g离心15 min。收集上清液，再提取剩余物2 次，合并上清液，补充提取液至15 mL。以上清液为粗提取物待用。

DPPH 自由基清除能力测定参考Tang 等[20]的方法并稍加修改。将样品或水溶性维生素E（Trolox）溶液（25、62.5、125、250、500、750、1 000 μmol/L）加入到200 μL DPPH 溶液中。将混合物在室温、避光条件下反应4 h，测定517 nm 处吸光值。以200 μL DPPH 溶液（350 μmol/L）为空白。DPPH 自由基清除能力表示为每克马铃薯干重的μmol Trolox 当量（μmol TE/g）（y=-0.000 9x+0.055 5，r2=0.999 9）。

总酚含量（total phenolic content，TPC）通过福林-酚法测定。TPC 表示为每克干马铃薯质量（mg GAE/g）的没食子酸当量毫克数（y=0.004 9x+0.073 6，r2=0.999 9）。

1.3.6 活性氧的测定

过氧化氢的含量由过氧化氢试剂盒测定；超氧阴离子自由基产生速率由超氧阴离子检测试剂盒测定。

1.3.7 相关酶活性的测定

参考Li 等[19]方法测定多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、过氧化物酶（peroxidase，POD）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）活性，并按比例缩小而适用于96 孔板。

1.3.8 酶活比

酶活比的定义参考Li 等[19]，即贮藏期间防御酶（POD、CAT）和攻击酶（PPO、LOX）的比值，反映不同处理的马铃薯鲜切片对外界不利环境的抵抗能力，以此来评估外冷害造成的褐变防御能力，计算公式如下。

式中：R1～R4分别为POD 和PPO、CAT 和PPO、POD和LOX 以及CAT 和LOX 酶活比；P0为贮藏初期多酚氧化酶活性，U/g；Pn为贮藏末期多酚氧化酶活性，U/g；D0为贮藏初期过氧化物酶活性，U/g；Dn为贮藏末期过氧化物酶活性，U/g；C0为贮藏初期过氧化氢酶活性，U/g；Cn为贮藏末期过氧化氢酶活性，U/g；L0为贮藏初期脂氧合酶活性，U/g；Ln为贮藏后期脂氧合酶活性，U/g。

1.4 数据处理

所有数据采用Excel 365 进行数据统计及标准偏差的计算；SPASS 19.0 软件进行单因素方差分析；Origin 8.0 绘图。每组试验均重复3 次。

2 结果与分析

2.1 初始冰点和过冷点

马铃薯鲜切片的初始冰点和过冷点如表1 所示。

表1 马铃薯鲜切片初始冰点和过冷点Table 1 Initial freezing point and supercooling point of fresh-cut potatoes

由表1 可知，马铃薯鲜切片平均初始冰点为（-1.7±0.2）℃，且与Comandini 等[21]的研究结果相近。马铃薯鲜切片的过冷点范围为-2.5～-5.0 ℃，这表明其贮藏在-2 ℃条件下不会结冰。因此，本研究采用的SC 温度为（-2.0±0.1）℃。

2.2 MT+SC 处理对褐变指数的影响

颜色变化是评价鲜切马铃薯品质的关键指标之一，BI 越大说明褐变越严重。MT+SC 处理对褐变指数影响如图1 所示。

图1 MT+SC 处理对褐变指数的影响Fig.1 Effect of MT+SC treatment on the browning index

由图1 可知，在贮藏期间各组马铃薯的褐变指数都呈上升趋势，但两个处理组的BI 值显著低于对照组果实（P<0.05），其中MT+SC 处理组的BI 值最低，约为对照组的37.8%，表明MT+SC 处理组在维持鲜切马铃薯颜色方面具有较高的潜在价值。

2.3 MT+SC 处理对褐变相关酶活性和总酚含量的影响

鲜切果蔬的褐变系统很复杂，并受到多种因素影响，其中包括底物含量、细胞损伤和相关酶活性[19]。MT+SC 处理对PPO、PAL 活性以及总酚含量的影响如图2 所示。

图2 MT+SC 处理对褐变相关酶活性和总酚含量的影响Fig.2 Effects of MT+SC treatment on browning-related enzyme activities and the total phenolic content

PPO 和PAL 都与酶促褐变直接相关，PAL 则是参与控制酚类物质的合成。如图2a 所示，PAL 的活性在贮藏8 d 内整体先增加后下降，且MT+SC 组PAL 活性显著低于其余两组（P<0.05）。马铃薯切片后，PPO 从细胞膜中释放出来，并在氧气存在下与液泡中的酚类物质反应生成醌，醌进一步脱水并聚合形成深色物质。如图2b 所示，除前2 d 外，SC 组PPO 活性显著低于CK 组（P<0.05）；MT+SC 组在贮藏期间的PPO 活性显著低于其余两组（P<0.05）。SC 组两种酶活性的变化可能是由于低温抑制了酶的活性，进而延缓了鲜切马铃薯的褐变。而MC+SC 组对鲜切马铃薯的抑制褐变效果更佳。Li 等[22]的研究证明外源褪黑素处理降低了鲜切甘薯中PAL 和PPO 的活性。

酚类物质作为植物防御系统中重要的次生代谢产物具有较好的抗氧化作用，除了防止氢过氧化物成为活性氧自由基外，还可以螯合金属离子。如图2c 所示，在整个贮藏过程中各处理组的总酚含量整体上呈升高趋势。CK 组在贮藏最后一天的总酚含量高达11.13 mg/g，相比于初期增长了94%，而MT+SC 组相比于初期只增长19%。因此，在本研究中，联合处理有助于将总酚含量维持在更低水平。这可能是联合处理抑制了PAL 活性，进而抑制马铃薯鲜切片中酚类物质在贮藏期的积累。

2.4 MT+SC 处理对O2-、H2O2 和MDA 含量以及LOX活性的影响

通过测定O2-、H2O2和MDA 含量以及LOX 活性，研究SC 结合MT 处理对鲜切马铃薯的氧化水平的影响，结果见图3。

图3 MT+SC 处理对H2O2、O2-和MDA 含量以及LOX 活性的影响Fig.3 Effects of MT+SC treatment on H2O2，O2-and MDA contents and LOX activity

膜脂过氧化被认为是细胞损伤和组织老化的特征，这是由ROS 或脂质氧化酶（如LOX）触发的。过量的ROS 被LOX 催化，不饱和脂肪酸被氧化形成共轭的过氧脂肪酸，最终导致脂质过氧化的连锁反应。由图3a、图3b 可知，MT+SC 组的O2-含量和LOX 活性都显著低于SC 组和CK 组（P<0.05）。SC 组O2-含量又显著低于CK 组（P<0.05），而SC 组和CK 组的LOX 活性没有明显趋势。这可能是低温造成冷害，积累的大量O2-加速了膜脂过氧化，进而加剧了组织的冻伤和褐变，而MT 具有良好的抗氧化作用，在清除ROS 方面具有重要作用[15]，所以MT+SC 组可有效地降低膜脂过氧化水平。

H2O2和MDA 被认为是植物细胞膜中脂质过氧化的产物。H2O2和MDA 的积累可以破坏细胞膜，从而促进棕色聚合物的积累，并导致果实褐变。如图3c 所示，CK 组H2O2积累量增加迅速且明显高于其余两组；而MT+SC 组上升缓慢且显著低于其余两组（P<0.05）。同时Li 等[22]、Liu 等[23]、Zheng 等[24]的研究发现MT 处理在延缓H2O2积累方面具有显著效果。因此SC 结合MT 处理有效地提高了鲜切马铃薯的抗氧化能力，减少了H2O2的积累。由图3d 可知，SC 组的MDA 积累量在贮藏的第2～6 天显著高于其余两组（P<0.05）；MT+SC 组在贮藏期间MDA 积累量低于CK 组。这可能是由于过冷处理温度过低造成了冷害，有研究显示，褪黑素可以通过抑制MDA 含量来减少冷害的发生[25]。因此，MT+SC 处理可以有效抑制冷害造成的MDA 的积累，进而降低膜脂过氧化水平。

2.5 MT+SC 处理对抗氧化能力的影响

通过测定POD 和CAT 活性以及DPPH 自由基清除能力，研究SC 结合MT 处理对鲜切马铃薯的抗氧化能力的影响，结果见图4。

图4 MT+SC 处理对抗氧化能力的影响Fig.4 Effect of MT+SC treatment on antioxidant capacity

POD 和CAT 是清除自由基最重要的酶。由图4a可知，贮藏第2～6 天MT+SC 处理组POD 活性显著低于CK 组（P<0.05）。这可能是由于CK 组和SC 组产生更多的H2O2，进而诱导POD 活性升高。在整个贮藏期间，MT+SC 组的POD 活性最低，这表明MT+SC 组减少了细胞内活性氧和自由基的积累，从而维持了较好的细胞膜完整性。由图4b 可知，CK 组、MT+SC 组和SC 组CAT 活性均呈下降趋势，而MT+SC 组在第2～8 天CAT 活性无显著性变化，其活性分别为35.6、34.3、35.75、35.7 U/g，且在贮藏的第4～8 天中显著高于另外两组（P<0.05）。这可能是由于MT 通过增强CAT活力进而有效消除了H2O2，减少了鲜切马铃薯的氧化损伤。

植物的抗氧化能力可以用DPPH 自由基清除能力进行评估。由图4c 可知，SC 组的鲜切马铃薯的抗氧化能力显著高于CK 组（P<0.05）。研究表明，褪黑素可以对鲜切梨和草莓产生非生物胁迫，从而达到更高水平的抗氧化能力[26]。本研究发现MT+SC 处理提高了马铃薯鲜切片的抗氧化能力，并且在整个贮藏期间表现出的抗氧化能力下降幅度最少，表现出了最佳的DPPH 自由基清除能力。因此，MT+SC 处理提高了鲜切马铃薯的抗氧化能力，减少了活性氧引起的组织损伤。

2.6 酶活性比

酶活性比可用来评价处理方法对鲜切果蔬褐变方面的有效性[19]。酶活比是指单位时间内攻击酶和防御酶增量的比值，可以表示样品在贮藏期间的生命活性强度。MT+SC 处理对防御酶和攻击酶活性比的影响见图5。

图5 防御酶与攻击酶活性比Fig.5 Activity ratio of defense enzymes to attack enzymes

a.比率1；b.比率2；c.比率3；d.比率4。

由图5a 和图5b 可知，MT+SC 组的酶活性比率高于SC 组和CK 组。其中，第6 天MT+SC 组比率1 值达到最大，分别比SC 组和CK 组高2.64 倍和3.53 倍。这表明MT+SC 组可以有效抑制鲜切马铃薯的褐变效果。由图5c 和图5d 可知，MT+SC 组的酶活性比率均高于SC 组和CK 组。其中，第6 天MT+SC 组比率3、比率4 值达到最大。这表明MT 处理可使马铃薯块茎具有更强的抗氧化能力，以抵抗切割和SC 贮藏对鲜切马铃薯造成的伤害。

3 结论

为延长鲜切马铃薯货架期，探究MT+SC 处理对鲜切马铃薯品质的影响。研究结果表明，MT+SC 处理对抑制鲜切马铃薯果实褐变和增加抗寒性具有较好效果。MT+SC 处理显著抑制了PPO 活性和总酚含量升高，同时维持了较低的PAL 活性，并且显著减少了因低温造成的MDA 积累，不仅降低了膜脂质过氧化程度，而且保持了细胞膜的完整性。MT+SC 处理还提高了鲜切马铃薯的抗氧化能力，从而减少了自由基积累对细胞膜的损伤。综上所述，MT+SC 处理可以有效延长鲜切马铃薯的货架期，对于开发具有农业应用潜力的新型保鲜技术具有重要意义。