SR8278改善时差所致小鼠泪腺功能紊乱的转录组学分析△

黄深振 齐 迪 裴晓婷 路顶立 司宏丽 黄杜鎏睿 张文潇 巴梦茹 轩书婷 李志杰

时差是由快速穿越多个时区引起的内源性生物钟和外部周围环境的光-暗循环变化不同步现象。时差造成各种健康风险问题,包括炎症性肠病[1]、心血管疾病[2]、代谢疾病[3]、抑郁症[4]、神经退行性疾病[5]及癌症[6]等。经历时差和轮班工作后,人血液转录组中的转录组遭受不利影响,且转录组基因数目减少[7]。研究表明,时差会损伤小鼠眶外泪腺的结构和功能,并使泪腺的昼夜节律遭到破坏,改变核受体亚家族1 D组成员1(NR1D1)的昼夜节律和表达量[8]。SR8278是NR1D1的合成拮抗剂[9],可抑制NR1D1介导的转录抑制。然而,SR8278是否可以改善时差造成的泪腺功能紊乱目前尚不十分清楚。因此,本研究利用光照周期相位前移建立时差小鼠模型,探讨SR8278改善时差造成小鼠眶外泪腺结构和功能的效果及可能机制。本研究将有助于理解时差或轮班工作期间泪腺转录组和功能的变化,以及为专门针对时差和与时差相关眼表疾病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料及试剂

SR8278(货号HY-14415,MedChemExpress,美国);盐酸匹罗卡品(浓度为0.45 g·L-1,货号HY-B0726,MedChemExpress,美国);磷酸盐缓冲盐溶液(货号G0002,Servicebio Company,中国武汉);牛血清白蛋白(货号G5001,Servicebio公司,武汉,中国);β-连环蛋白抗体(货号GB11015,Servicebio公司,中国武汉);苏木精溶液(货号G1004,Servicebio公司,中国武汉);RNAeasy旋转柱试剂盒(Qiagen,Hilden,德国)。

1.2 实验动物及时差模型建立

于南京模式动物研究所(中国南京)购买36只健康的8～10周龄野生型C57BL/6J雄性小鼠。小鼠饲养在温度和湿度恒定的12 h光亮/12 h黑暗周期节律箱中,并可以自由饮水和进食。小鼠适应以上环境2周后,并且部分小鼠植入发射器在节律箱内恢复2周后建立时差模型,时差模型建立参考之前的研究方案[8,10-11],将光照周期相位前移8 h。将小鼠分为正常组(未建立时差的小鼠)、时差组(建立时差的小鼠)和时差+SR8278组(建立时差,并给予25 mg·kg-1的SR8278干预),每组12只,共干预5 d。本研究中所有动物实验涉及视力和眼科方面的研究均按照视觉和眼科研究协会说明书中规定的使用指南进行,并获河南省人民医院动物护理和使用委员会批准(批号:HNEECA-2022-02)。

1.3 方法

1.3.1 小鼠活动度和核心体温检测

参考之前的研究方法[12-17],通过无线遥测系统(model ER-4000 E-Mitter,Sunriver,OR,美国)获得C57BL/6J雄性小鼠的活动度和核心体温数据。具体执行步骤如下:小鼠适应以上周期节律箱环境2周后,将各组随机3只小鼠麻醉后在腹腔内植入发射器。缝合伤口后,小鼠在节律箱内恢复2周后建立1.2中的分组。将含有发射器的小鼠放置在无线遥测接收器上,收集小鼠的活动度和核心体温。将数据收集软件设置为5 min和20 min分别监测一次小鼠的活动度和核心体温。

1.3.2 小鼠泪液分泌量测试

小鼠泪液测试方法参考之前的研究方案[8,15,18]。各组随机选择剩余9只中的3只小鼠,将生理盐水配制的盐酸匹罗卡品注射到小鼠腹腔(4.5 mg·kg-1)后,用无菌镊子将一根弯曲的酚红棉线末端放置在眼睛内眼角20 s,测量浸润长度并记录。

1.3.3 免疫组织化学法评估眶外泪腺

参考之前的研究方案[13,15],采用免疫组织化学方法对小鼠眶外泪腺进行组织学评估。各组随机选择剩余6只中的3只小鼠处死,摘取双侧泪腺组织,于100 g·L-1磷酸盐缓冲福尔马林中保存24 h,之后短暂包埋在石蜡中。将包埋的石蜡切片(5 μm),通过二甲苯和75%～100%乙醇进行脱蜡和再水合。为了淬灭内源性过氧化物酶,切片采用pH值为7.4的磷酸盐缓冲盐溶液洗涤,然后在30 g·L-1过氧化氢中浸泡5 min。将切片在pH值为7.4的磷酸盐缓冲盐溶液中加入30 g·L-1牛血清白蛋白中洗涤和封闭30 min,并与抗β-连环蛋白抗体一起孵育。然后将切片与二抗在室温下孵育50 min。细胞核被Mayer的苏木精溶液染色。最后,将切片封装并在显微镜下检查并拍照。

1.3.4 组织样品收集和RNA高通量测序

在实验终点,将3组各剩余的最后3只小鼠采用颈椎脱臼的方法处死,然后立即收集小鼠的2个眶外泪腺组织,使用分析天平(MS105DU,Mettler Toledo,瑞士)称量泪腺重量,并迅速将眶外泪腺组织转移至-80℃冰箱保存。按照TRIzol RNA提取方案,采用RNAeasy旋转柱试剂盒提取RNA。然后将各组小鼠中每一只小鼠的2个泪腺的RNA分别汇集到一个独立的样品管中,共计9个RNA样品分别用于高通量RNA测序分析。按照测序方法[16,19],在北京基因组研究所(华大基因研究院,中国深圳)进行包含NR1D1的RNA-Seq测序分析。

1.3.5 KEGG和GO功能富集分析

差异基因进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能注释分析[12,15]。本研究使用blastall软件[National Center for Biotechnology Information (NCBI),贝塞斯达,马里兰州,美国]对KEGG数据库V81.0和NCBI RefSeq(GCF_000001635.25_GRCm38.p5)进行KEGG路径注释。P<0.05的途径被认为显著富集了差异表达基因。候选基因的分子功能和生物学过程通过基因本体(GO)进行分析[20-21]。该分析首先将所有候选基因映射到GO数据库(http://www.geneontology.org)的每个术语,并计算每个术语的基因数量。然后应用超几何学测试从该物种的所有遗传背景中确定候选基因生物学功能方面的重要性。阈值设置为P<0.05。

1.4 统计学处理

采用SPSS 27.0统计学软件进行数据分析,实验结果均数±标准差表示。各组活动度、核心体温、泪腺重量、泪液分泌和细胞体积比较采用单因素方差分析。包含NR1D1的RNA-Seq高通量测序获得的数据通过SOAPnuke(1.5.2版本)软件进行过滤。使用 Bowtie2(2.2.5版本)软件将干净的读数与参考编码基因集进行比对,然后使用 RSEM(1.2.12版本)软件计算包含NR1D1基因的表达水平。检验水准:α=0.05。

2 结果

2.1 SR8278改善时差小鼠的活动度和核心体温

各组小鼠的活动度和核心体温变化见图1。正常组小鼠的活动度和核心体温具有昼夜变化规律,其夜间的活动度及核心体温均高于白天(均为P<0.001)。与正常组相比,时差组小鼠白天活动度较高,夜间活动度较低,白天核心体温较高,夜间核心体温较低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。时差改变了正常小鼠的运动规律与核心体温。与时差组相比,时差+SR8278组小鼠白天活动度较低,夜间活动度较高,白天核心体温较低,夜间核心体温较高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。SR8278改善了时差小鼠昼夜活动度和核心体温变化。

A:3组小鼠24 h活动度变化曲线;B:3组小鼠白天及夜间的活动度平均值;C:3组小鼠24 h的核心体温变化曲线;D:3组小鼠白天及夜间的核心体温平均值。黑色阴影代表昼夜时间中的黑暗期间,白色背景代表昼夜时间的光亮期间。两组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。图1 正常组、时差组及时差+SR8278组小鼠24 h活动度和核心体温变化比较

2.2 SR8278改善时差小鼠泪腺重量、泪液分泌量及细胞大小

与正常组相比,时差组小鼠泪腺重量及泪液分泌量降低,泪腺细胞增大,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与时差组相比,时差+SR8278组小鼠泪腺重量及泪液分泌量增加,泪腺细胞减小,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

与正常组相比,时差组小鼠夜晚泪腺中NR1D1表达量较高;与时差组相比,时差+SR8278组小鼠夜晚泪腺中NR1D1表达量较低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图2)。

A:3组小鼠泪腺重量比较;B:3组小鼠泪液分泌量比较;C:3组小鼠泪腺细胞大小比较;D:正常组小鼠泪腺细胞大小典型免疫组织化学图;E:时差组小鼠泪腺细胞大小典型免疫组织化学图;F:时差+SR8278组小鼠泪腺细胞大小典型免疫组织化学图;G:3组小鼠泪腺中NR1D1的mRNA表达量比较。两组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,ns示差异无统计学意义。图2 正常组、时差组及时差+SR8278组小鼠泪腺重量、泪液分泌量及细胞大小比较

2.3 SR8278影响时差小鼠泪腺的差异基因数目

正常组和时差组共有602个显著性差异基因,其中显著性上调基因416个,显著性下调基因186个。时差组和时差+SR8278组共有947个显著性差异基因,其中显著性上调基因43个,显著性下调基因904个(图3)。

A:正常组与时差组的差异表达基因火山图;B:时差组与时差+SR8278组的差异表达基因火山图。图3 正常组、时差组及时差+SR8278组小鼠差异表达基因分析

2.4 SR8278影响小鼠泪腺的KEGG通路

正常组与时差组小鼠的差异基因富集前10名KEGG通路可以分为3类(图4A):(1)代谢:代谢途径,氧化磷酸化,碳代谢,糖胺聚糖生物合成,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,C5-支链二元酸代谢及不饱和脂肪酸的生物合成;(2)遗传信息处理:硫继电器系统和核糖体;(3)有机系统:PPAR信号通路。时差组与时差+SR8278组小鼠的差异基因富集前10名KEGG通路可以分为3类(图4B):(1)代谢:甘油脂质代谢和磷酸肌醇代谢;(2)环境信息处理:Notch信号通路,Hippo信号通路,mTOR信号通路,Wnt信号通路,AMPK信号通路及MAPK信号通路;(3)有机系统:甲状腺激素信号通路和轴突引导。

A:正常组与时差组差异表达基因KEGG信号通路富集分析柱状图;B:时差组与时差+SR8278组差异表达基因KEGG信号通路富集分析柱状图。图中显示的是P<0.05的前10名通路。图4 正常组、时差组及时差+SR8278组小鼠差异表达基因KEGG信号通路富集分析和GO注释分析

2.5 SR8278影响时差小鼠泪腺的生物学过程

正常组与时差组小鼠泪腺差异基因富集前10名GO_生物学过程可以分为4类(图5A):(1)代谢过程:长链脂肪酸代谢过程,有氧呼吸,胞质翻译及超长链脂肪酸代谢过程;(2)对刺激的反应:急性期反应;(3)发育过程:心房形态发生,流出道隔形态发生,T淋巴细胞分化及组织发育;(4)免疫系统过程:抗菌肽介导的抗菌体液免疫反应。时差组与时差+SR8278组小鼠泪腺差异基因富集前10名GO_生物学过程可以分为3类(图5B):(1)代谢过程:RNA聚合酶II对转录的负调控,磷酸化,蛋白质磷酸化及蛋白质自磷酸化;(2)发育过程:神经管闭合术,参与神经管闭合的平面细胞极性通路,血管发生,血管发育混合肺发育;(3)生物调节:GTP酶活性的正调节。

A:正常组与时差组差异表达基因GO_生物学过程富集分析气泡图;B:时差组与时差+SR8278组差异表达基因GO_生物学过程富集分析气泡图;C:正常组与时差组差异表达基因GO_分子功能富集分析气泡图;D:时差组与时差+SR8278组差异表达基因GO_分子功能富集分析气泡图。图中显示的是P<0.05的前10名通路。图5 正常组、时差组及时差+SR8278组小鼠差异表达基因GO注释分析

正常组与时差组小鼠泪腺差异基因富集前10名GO_分子功能可以分为5类(图5C):(1)催化活性:硫酯水解酶活性,NADH脱氢酶(泛醌)活性,乙酰半乳糖氨基转移酶活性,醛脱氢酶[NAD(P)+]活性及硫代硫酸盐硫转移酶活性;(2)分子转换活性:五聚蛋白受体活性;(3)结构分子活性:核糖体的结构成分;(4)整合:信息素活性及小分子结合;(5)转运蛋白活性:脂肪酸跨膜转运蛋白活性。时差组与时差+SR8278组小鼠泪腺差异基因富集前10名GO_分子功能可以分为4类(图5D):(1)催化活性:转移酶活性,激酶活性,蛋白激酶活性,组蛋白甲基转移酶活性(H3-K4 特异性);(2)分子功能调节剂:鸟苷酸交换因子活性,GTP酶激活剂活性;(3)整合:Rho鸟苷酸交换因子活性,蛋白质结合,PDZ域绑定;(4)转录调节活性:转录共激活因子活性。

3 讨论

时差也被称为昼夜节律不同步,是由于人们快速跨越多个时区,与身体的自然昼夜节律和外部环境不匹配引起的一种睡眠障碍[22]。时差可影响所有年龄段的人群,且对老年人的影响可能更明显。时差的不良反应程度包含许多因素,如跨越时区的数量、航班的方向和时间。个体的差异性解释了适应新时区的能力和症状期的持续时间。旅行者通常在跨越至少2个时区的航空旅行后出现不适症状,不适症状包括睡眠紊乱、白天疲劳、执行脑力和体力任务的能力下降、警觉性降低和头痛等[23-24]。睡眠障碍通常会持续几天,但如果时区变化超过8 h,睡眠障碍可能会持续长达一周。虽然频繁的去同步是一种短暂的疾病,但流行病学和动物研究证明,时差可能导致长期的不良后果,如认知障碍、胃肠功能障碍紊乱,并增加癌症、不孕症和心脏病的风险[3,22]。

泪膜是眼表与外界环境的重要界面,其对于维持眼表稳态和角膜光学功能具有重要作用[25]。泪膜由3层组成,从前到后分别为脂质层、水层和黏蛋白层。泪腺通过分泌泪膜的水层维持眼表的稳定性和角膜视觉功能,从而维持眼睛的健康和功能[26-27]。泪腺的分泌受多种因素影响,如更年期[28]、糖尿病[18]、衰老[17]、时差[8]及高脂饮食[16],以上这些因素均会降低泪腺的分泌功能,威胁眼表健康。有研究发现,时差可重编程小鼠泪腺的昼夜转录组,损伤小鼠泪腺的重量、细胞大小及泪液分泌量[8]。然而是否可以通过药理学干预策略改善时差造成的泪腺结构和功能损伤目前尚不十分清楚。SR8278作为NR1D1的拮抗剂,可以抑制NR1D1介导的转录抑制[9]。本研究利用光照周期相位前移建立时差小鼠模型,探讨SR8278改善时差造成小鼠眶外泪腺结构和功能的效果及可能机制。Xue等[29]研究发现,SR8278可以促进损伤后角膜的有丝分裂和再上皮化动力学过程,从而促进角膜损伤后修复。Guo等[30]研究发现,SR8278通过靶向抑制NR1D1/2限制了铁死亡,从而改善小鼠叶酸诱导的急性肾损伤。Lee等[31]研究发现,SR8278通过拮抗NR1D1/2可减轻阿尔茨海默病小鼠模型中的淀粉样蛋白斑块沉积。本研究通过时差小鼠体内SR8278干预发现,其不仅可以改善时差小鼠的活动度和核心体温,还可改善时差小鼠的泪腺重量、泪液分泌量及细胞大小。进一步的功能富集分析发现,SR8278可能是通过Notch信号通路影响了小鼠泪腺的功能。

4 结论

SR8278可通过靶向抑制NR1D1,重编程小鼠泪腺的转录组,改变KEGG信号通路、GO_分子功能及GO_生物学过程,改善小鼠泪腺的重量和分泌功能,其过程可能是通过Notch信号通路完成的。这一结果可为临床上因为时差导致的泪腺功能紊乱的治疗提供新思路,但SR8278对泪腺的昼夜节律影响和具体的作用机制仍需进一步研究。