葡萄糖转运蛋白GLUT1/4和Sirtuins在糖尿病大鼠视网膜中的表达△

白文帆 郭 玉 伏等弟 罗明秀 芦晓红 姚 青

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病严重的微血管并发症,也是导致成人视力丧失的主要原因[1],探索DR的发病机制,寻找其预防及治疗方法具有重要的临床意义。葡萄糖转运蛋白GLUT是一类可调控葡萄糖进入细胞内的跨膜蛋白。目前已鉴定出GLUT家族包含14种蛋白,GLUT1是主要的葡萄糖转运载体,参与葡萄糖代谢[2-3];GLUT4能够在胰岛素的刺激下,通过易位作用转运到细胞膜上调控葡萄糖进入细胞[4]。此外,Sirtuins作为一类具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性去乙酰酶活性的蛋白,已被证明与心血管疾病、糖尿病、癌症等有密切关系[5]。本研究探讨GLUT1/4和Sirtuins在糖尿病大鼠视网膜中的表达,旨在进一步研究DR的发病机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

链脲佐菌素、无水乙醇、二甲苯、中性树胶、HE染色试剂盒 (北京索莱宝科技有限公司),BCA蛋白定量检测试剂盒、全蛋白提取试剂盒、ECL化学发光液(江苏凯基生物技术股份有限公司),DAB显色试剂盒 (上海生工生物工程股份有限公司),SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、预染蛋白Maker (上海雅酶生物医药科技有限公司),SIRT1、SIRT6抗体 (美国Cell Signaling公司),β-actin、SIRT2、SIRT3和SIRT7抗体 (美国Affinityg公司),SIRT4、STRT5和GLUT1/4抗体 (武汉三鹰生物技术有限公司)。全数字彩色多普勒超声诊断仪 (上海中跃医疗仪器公司),台式高速冷冻型微量离心机 (北京大龙兴创实验仪器公司),荧光定量PCR仪 (美国Bio-Rad公司),化学发光成像仪 (美国Thermo Scientific公司),黏附载玻片、YD-14P1.5智能环保型双吊篮生物组织脱水机、YD-6LA生物组织冷冻包埋机、RWDS700轮转式切片机、YD-700全自动生物组织染色机 (深圳市瑞沃德生命科技有限公司),ML31生物显微镜(广州市明美科技有限公司),Science数字切片扫描系统 (山东志盈医学科技有限公司)。

1.2 糖尿病大鼠模型的建立

取8周龄健康雄性SD大鼠20只,体重200～220 g(购自宁夏医科大学实验动物中心)。大鼠禁食12 h后,抽取尾静脉血测定空腹血糖,将20只血糖正常的大鼠随机分为正常对照组和糖尿病组,糖尿病组大鼠按照60 mg·kg-1的剂量采用一次性腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病模型,正常对照组大鼠注射等量的溶剂。3 d 后尾静脉采血检测血糖,空腹血糖≥ 16.7 mmol·L-1为糖尿病造模成功,每隔2周检测大鼠体重和血糖。本实验通过宁夏医科大学医学实验动物伦理委员会审查并获批准(伦理批准号:IACUC-NYLAC-2021-115)。

1.3 彩色多普勒超声检测大鼠视网膜中央动脉的血流参数

造模后12周,使用异氟烷吸入麻醉剂麻醉大鼠,固定大鼠四肢并且对大鼠眼部周围进行脱毛,将超声耦合剂均匀涂抹在眼部,探头放至耦合剂表面进行探查,检测大鼠视网膜中央动脉(CRA)的收缩期峰值流速(PSV)和舒张末期流速(EDV),并计算阻力指数(RI)、搏动指数(PI)。

1.4 HE染色观察大鼠视网膜组织病理学变化

造模后12周,用10 g·L-1戊巴比妥钠注射液 (5 mL·kg-1) 右下腹腔注射麻醉大鼠,腹主静脉采血后,取出眼球并放入装有眼球固定液的离心管中进行固定,脱水,石蜡包埋,切片,苏木素染色5 min,清洗,伊红染色20 min,脱水,封片,在光学显微镜下观察视网膜组织的病理学形态。

1.5 免疫组织化学染色观察大鼠视网膜中GLUT1/4的表达情况

将石蜡切片放入60 ℃烤片机中烤20 min,脱蜡水化,置于修复液中煮沸后冷却至室温,用PBS清洗,H2O2阻断15 min,封闭20 min后孵育一抗 (GLUT1 1：5 000,GLUT4 1：300),4 ℃过夜,PBS清洗3次,37 ℃避光孵育辣根过氧化物酶标记的二抗 (1：5 000) 1 h,再用PBS清洗后,加入DAB显色,滴加苏木素,脱水,封片,在光学显微镜下观察大鼠视网膜中GLUT1/4的表达情况。

1.6 Western blot检测大鼠视网膜GLUT1/4和Sirtuins蛋白的表达情况

将眼球沿着角巩膜缘剪开,取出视网膜后置于裂解液中,用研钵充分粉碎组织。离心,取上清。通过BCA试剂盒检测样本蛋白浓度,将蛋白通过 SDS-PAGE分离后转印到PVDF膜上,用100 g·L-1的脱脂牛奶封闭2 h后孵育一抗 (β-actin 1：5 000,SIRT1-7 1：1 000,GLUT1 1：4 000,GLUT4 1：2 000)。放摇床中4 ℃孵育过夜。次日,用TBST洗膜后孵育二抗 (1：5 000),配置ECL发光液,在凝胶成像系统曝光,检测灰度值,计算GLUT1/4和Sirtuins蛋白相对表达量。

1.7 qRT-PCR检测大鼠视网膜中Sirtuins mRNA的表达水平

采用Trizol一步法提取视网膜总RNA,逆转录后从GenBank获得目的基因mRNA的全长序列,利用Primer 5.0设计引物序列,Sirtuins及β-actin的引物序列见表1。采用qRT-PCR检测大鼠视网膜中Sirtuins mRNA的表达水平。

表1 Sirtuins及β-actin的引物序列

1.8 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析,使用Graphpad Pism 9.5制图。计量资料以均数±标准差表示,采用独立样本t检验进行分析。检验水准:α=0.05。

2 结果

2.1 两组大鼠体重和血糖的变化

与正常对照组相比,糖尿病组大鼠均出现多饮、多食、多尿、体重减轻等症状。造模8周后糖尿病组大鼠体重显著低于正常对照组(均为P<0.05);链脲佐菌素注射2周后,糖尿病组大鼠血糖显著高于正常对照组 (均为P<0.05) (图1)。

与正常对照组相比,*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001。图1 两组大鼠造模后不同时间体重和血糖的变化

2.2 两组大鼠CRA的血流参数

造模后12周,与正常对照组相比,糖尿病组大鼠CRA的PSV和EDV均显著降低 (均为P<0.001);RI与PI无明显改变(均为P>0.05) (表2)。

表2 造模后12周两组大鼠CRA血流参数

2.3 两组大鼠视网膜HE染色结果

HE染色结果显示,正常对照组大鼠视网膜组织各层结构清晰,细胞排列紧密、规则,未发现明显的病理改变;糖尿病组大鼠视网膜组织厚度变薄,各层界限模糊,结构紊乱,细胞数量减少 (图2)。

GCL:神经节细胞层;IPL:内丛状层;INL:内核层;OPL:外丛状层;ONL:外核层;RCL:光感受器层;PEL:色素上皮层。图2 造模后12周两组大鼠视网膜HE染色结果(×400)

2.4 两组大鼠视网膜中GLUT1/4的表达情况

免疫组织化学染色结果显示,在大鼠视网膜中GLUT1主要位于视网膜色素上皮层,GLUT4位于神经节细胞层、内丛状层及光感受器层;与正常对照组相比,糖尿病组大鼠视网膜中GLUT1及GLUT4的表达减少(图3A);Western blot检测结果也表明,糖尿病组大鼠视网膜中GLUT1 及GLUT4蛋白相对表达量均低于正常对照组(均为P<0.05) (图3B,表3)。

A:免疫组织化学染色结果(×400);黑色箭头示色素上皮层,红色箭头示神经节细胞层,黄色箭头示内丛状层,绿色箭头示光感受器层。B:Western blot检测结果。图3 两组大鼠视网膜中GLUT1/4的表达情况

表3 两组大鼠视网膜中GLUT1 及GLUT4蛋白相对表达量

2.5 两组大鼠视网膜中Sirtuins 蛋白表达情况

Western blot检测结果显示,糖尿病组大鼠视网膜中SIRT1-SIRT7蛋白相对表达量均低于正常对照组(均为P<0.05)(表4)。

表4 两组大鼠视网膜中Sirtuins蛋白相对表达量

2.6 两组大鼠视网膜中Sirtuins mRNA的表达情况

qRT-PCR检测结果显示,与正常对照组相比,糖尿病组大鼠视网膜中的SIRT1-SIRT7 mRNA相对表达量均下降,差异均有统计学意义(均为P<0.01)(表5)。

表5 两组大鼠视网膜中Sirtuins mRNA相对表达量

3 讨论

目前,我国糖尿病的发病率为13%,DR作为糖尿病患者最常见的眼部并发症,其发病率约占糖尿病患者总数的40%,是导致成人视力丧失的主要原因,预计到2030年全球DR患者数可能达到1.91亿[6-8]。DR的发病机制复杂,现有的临床治疗手段无法有效控制病情。因此,探索DR的发病机制,寻找预防及治疗DR安全且有效的方法具有重要的现实意义。

DR的主要病理改变包括视网膜缺血、血管渗透性增加和神经元异常等。本研究显示,糖尿病组大鼠CRA的PSV和EDV均下降,说明视网膜血流速度下降,供血减少。病理组织学结果显示,糖尿病大鼠视网膜组织各层变薄、结构紊乱、细胞大量丢失,表明糖尿病大鼠视网膜功能和结构发生紊乱。GLUT是一类跨膜蛋白,可转运葡萄糖进入细胞内,根据其序列相似性和底物亲和力可将GLUT分为三类:I类GLUTs (1-4、14) 可促进葡萄糖的摄取,II 类 GLUT(5、7、9、11)是果糖转运蛋白,III 类 GLUT (6、8、10、12、13)是结构上非典型成员[9]。GLUT1是一类广泛分布于各个组织器官的葡萄糖转运体,是葡萄糖通过血-视网膜屏障的载体,主要定位于视网膜血管内皮细胞和色素上皮细胞层,是维持视网膜葡萄糖供给平衡的重要因素,在高糖环境中视网膜细胞GLUT1出现异常,将会导致视网膜的糖代谢紊乱[10]。GLUT4是骨骼肌和脂肪组织中最主要的葡萄糖转运载体,在胰岛素刺激下,GLUT4通过将葡萄糖由细胞外转位至细胞中,而发挥降血糖的作用。有研究表明,上调GLUT4可改善高糖合并缺血缺氧心肌细胞的糖代谢异常状态[11]。本研究结果显示糖尿病大鼠视网膜组织GLUT1和GLUT4蛋白表达水平下降。

Sirtuins是一类具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性去乙酰酶活性的蛋白质,主要与DNA修复、细胞周期、代谢和衰老的调节有关,该家族由7种亚型组成,其中SIRT1和SIRT2位于细胞核及细胞质中。研究表明,白内障、青光眼和DR等眼部病变都与SIRT1的表达有关,SIRT1可通过调节细胞凋亡、炎症和氧化应激改善DR[12];SIRT2可通过调节胰岛素的作用来改善细胞状态,下调SIRT2会加重胰岛素抵抗[13];SIRT3、SIRT4和SIRT5主要位于线粒体基质中,SIRT3可通过抑制血管内皮生长因子表达及促进细胞自噬从而预防DR[14];SIRT4是维持胰岛素分泌和葡萄糖稳态的关键参与者[15];SIRT5可通过对视神经磷酸酶去琥珀酰化保护视网膜神经节细胞免受DR引起的损伤[16];SIRT6定位于细胞核,可抑制血管内皮生长因子表达,改善DR小鼠的炎症反应、氧化应激且能缓解视网膜细胞凋亡[17-18];SIRT7主要位于核仁中,可通过p53去乙酰化抑制细胞凋亡和缓解miR-335-5p诱导的内皮细胞功能障碍[19-20]。本研究结果显示糖尿病大鼠视网膜组织中SIRT1-SIRT7蛋白及mRNA均呈低表达状态,提示Sirtuins在DR中可能发挥正向调控的作用。

4 结论

糖尿病可引起大鼠视网膜组织中GLUT1/4和Sirtuins的表达发生改变,GLUT1/4和Sirtuins可能参与了DR的发生与发展。