西藏芫根中总多糖含量测定方法及单糖指纹图谱研究*

吕倩倩，谢和兵，4△，尼玛次仁，白玛旦增

（1.安徽中医药大学，安徽合肥 230013； 2.江苏省南通市海门长三角药物高等研究院，江苏南通 226133；3.江苏神猴医药研究有限公司，江苏南通 226133； 4.西藏神猴药业有限责任公司，西藏日喀则 857000）

芫根Brassica rapaL.又名芜菁、蔓菁，藏语名为妞玛，味甘，性温，有清热解毒、滋补增氧之功效，是青藏高原地区特有的食、药、饲三用植物［1］。芫根生长周期快，适应性和抗逆性较强，含有多糖［2］、黄酮［3］、皂苷［4］、硫代葡萄糖苷［5］等多种生物活性成分，有效增强免疫力［6］，起到抗辐射、抗疲劳、抗菌抗炎［7］、降血糖［8］、抗缺氧［9-10］等作用，在医疗、食品等行业中具有广泛的应用价值。芫根药材现行标准为《西藏自治区藏药材标准：第2 册》［11］，但仅包括性状、薄层鉴别、炮制、性味，无成分的定量指标，药材质量控制水平较低，亟须提高。本研究中采用紫外分光光度法测定芫根中总多糖的含量，并建立单糖柱前衍生高效液相色谱指纹图谱，旨在为西藏芫根药材的质量标准制订提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

20B 型高效万能粉碎机（常州市强迪干燥设备有限公司）；LC-16A型高效液相色谱仪，UV-1900i型紫外可见分光光度计，均购自日本Shimadzu公司；JA10003N型电子天平（精度为千分之一），DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱，UC-250DE型超声清洗仪（功率为250 W，频率为50 kHz），均购自上海精其仪器有限公司；XSR205DU/ AC 型分析天平（美国Mettler Toledo 公司，精度为十万分之一）；HH - 6 型数显恒温水浴锅（上海力辰邦西仪器科技有限公司）；PHS-3C 型雷磁酸度计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；XH - C 型涡旋振荡器（常州中捷实验仪器制造有限公司）。

1.2 试药

D- 无水葡萄糖对照品（批号为110833 - 202109，纯度为99.9%），半乳糖对照品（批号为100226 -201807，纯度为100.0%），D- 甘露糖对照品（批号为140651 - 201805，纯度为100.0%），D- 葡萄糖醛酸对照品（批号为140648 - 202005，纯度为99.1%），D- 半乳糖醛酸对照品（批号为111646 - 201702，纯度为95.1%），鼠李糖对照品（批号为111683 - 201502），阿拉伯糖对照品（批号为111506 - 200202），均购自中国食品药品检定研究院；苯酚（批号为20220110），甲醇（分析纯，批号为20220824），氢氧化钠（分析纯，批号为20210220），硫酸（批号为20211202），磷酸二氢钾（分析纯，批号为20220514），1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，化学纯，批号为20220316），三氟乙酸（分析纯，批号为20220105），三氯甲烷（批号为20211208），均购自国药集团化学试剂有限公司；盐酸（上海泰坦科技股份有限公司，批号为P2141688）。芫根药材由西藏神猴药业有限责任公司提供，经该公司尼玛次仁副主任藏药师鉴定为正品，样品信息见表1。

表1 芜根药材样品信息Tab.1 Information of Brassica rapa samples

2 方法与结果

2.1 总多糖含量测定

2.1.1 溶液制备

取D-无水葡萄糖对照品10.30 mg，精密称定，置20 mL 容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容，摇匀，即得对照品贮备液；精密吸取对照品贮备液100 μL，置具塞试管中，加蒸馏水900 μL，摇匀，加5%苯酚溶液1 mL，摇匀，加5 mL 浓硫酸，混匀，称定质量，置沸水浴中加热15 min，室温冷却，加蒸馏水补足减失的质量，即得对照品溶液。

取芫根粉末（过4 号筛）2.0 g，精密称定，置锥形瓶中，加蒸馏水60 mL，称定质量，90 ℃水浴加热回流1 h，放冷，用水补足减失的质量，滤过。精密吸取滤液1.5 mL，置25 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀，即得供试品贮备液［12］；精密吸取供试品贮备液100 μL，置具塞试管中，加蒸馏水900 μL，摇匀，加5%苯酚溶液1 mL，摇匀，再加5 mL 浓硫酸，混匀，称定质量，置沸水浴中加热15 min，室温冷却，加蒸馏水补足减失的质量，即得供试品溶液。

2.1.2 方法学考察［13-14］

线性关系考察：精密吸取25，50，100，150，200，250 μLD-无水葡萄糖对照品贮备液，分别置具塞试管中，分别加入蒸馏水975，950，900，850，800，750 μL，按2.1.1项下方法制备系列浓度标准品溶液，于484 nm波长处测定吸光度，以吸光度（Y）为纵坐标、D-无水葡萄糖质量浓度（X，mg/L）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=0.0 685X+0.001 5（r=0.999 5，n= 6），表明D- 无水葡萄糖质量浓度在1.84～18.37 mg/L 范围内与吸光度线性关系良好。

精密度试验：取2.1.1 项下对照品溶液，于484 nm波长处测定吸光度6 次。结果吸光度的RSD为0.18%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为202211171）芫根粉末（过4 号筛），精密称定，按2.1.1 项下方法平行制备供试品溶液6 份，于484 nm 波长处测定吸光度，并计算样品含量（以干品计）。结果样品含量的RSD为0.35%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取2.1.1 项下供试品溶液，分别于0，1，3，6，12，18，24 h 时在484 nm 波长处测定吸光度。结果供试品溶液吸光度的RSD为1.52%（n= 7），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

加样回收试验：取同一批（批号为202211171）芫根粉末（过4 号筛）适量，精密称定，按2.1.1 项下方法平行制备供试品贮备液6份，分别精密吸取供试品贮备液50 μL和2.1.1项下D-无水葡萄糖对照品贮备液50 μL，置同一具塞试管中，按2.1.1 项下方法制备供试品溶液，于484 nm 波长处测定吸光度，每份连续测定2 次，计算平均加样回收率。结果见表2。

表2 总多糖加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test of total polysaccharide（n = 6）

2.1.3 总多糖含量测定

取6批（批号分别为20220315，202211171，202211172，202211173，20220708，20220725）芫根粉末（过4 号筛），按2.1.1项下方法制备供试品溶液，每批样品平行3 份，于484 nm 波长处测定吸光度，每份连续测定2 次。结果总多糖的含量（以干品计）分别为323.12，272.53，274.91，286.44，234.68，321.18 mg/ g（n= 6），平均含量为285.48 mg/g。

2.2 指纹图谱建立与分析

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Ultimate XB - C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-pH 为6.8 的0.1%磷酸盐溶液（B），梯度洗脱（0～10 min时18%A～16%A，10～30 min时16%A～19%A，30～40 min 时19%A～21%A，40～45 min 时21%A，45～50 min 时21%A～18%A，50～55 min时18%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：250 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2.2 溶液制备

取半乳糖、D- 甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D- 无水葡萄糖、D- 葡萄糖醛酸、D- 半乳糖醛酸对照品各1.0 mg，精密称定，分别置50 mL 容量瓶中，加蒸馏水溶解，并定容，即得各单糖的对照品贮备液；分别取上述单糖对照品各1.0 mg，精密称定，置同一50 mL 容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容，即得混合对照品贮备溶液。精密吸取各单糖对照品贮备液、混合对照品贮备液各400 μL，分别置5 mL 离心管中，依次加入0.3 mol/L 氢氧化钠（NaOH）溶液400 μL、0.5 mol /L PMP 甲醇溶液400 μL，混匀，置70 ℃烘箱中反应30 min，取出，冷却至室温，加入0.3 mol/ L 氯化氢（HCl）溶液400 μL，混匀后加入1 mL 三氯甲烷，涡旋混合1 min，静置1 min，吸取上层液，0.45 μm 有机系微孔滤膜滤过，即得各单糖对照品溶液、混合对照品溶液。

取芫根粉末（过4 号筛）0.2 g，精密称定，置顶空瓶中，加2 mol /L 三氟乙酸溶液6 mL，密封，静置30 min，置120 ℃烘箱中，加热4 h，取出，冷却至室温，滤过，残渣用水洗涤2 次，每次约6 mL，合并滤液，用1 mol/ L NaOH 溶液调pH 至7.0，加蒸馏水定容至50 mL 容量瓶中，即得供试品贮备液。精密吸取供试品贮备液400 μL，置5 mL 离心管中，依次加入0.3 mol/ L NaOH 溶液、0.5 mol/L PMP 甲醇溶液各400 μL，混匀，置70 ℃烘箱中反应30 min，取出，冷却至室温，加入0.3 mol/L HCl溶液400 μL，混匀后加入1 mL 三氯甲烷，涡旋混合1 min，静置1 min，吸取上层液，0.45 μm 有机系微孔滤膜滤过，即得供试品溶液［15-16］。

2.2.3 指纹图谱建立与共有峰指认

取6 批芫根粉末（过4 号筛），分别按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，另取2.2.2 项下各单糖对照品溶液、混合对照品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定。对数据进行积分处理后，以AIA 格式导出，将指纹图谱依次导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.0版）中［17］，以S1 为参照，采用中位数法，时间窗宽度设为0.1，经多点校正和全谱峰匹配后［18-19］，生成6 批芫根药材样品色谱图的叠加指纹图谱（图1），共识别出19个共有峰，通过与混合对照品溶液色谱峰（图2）比对，指认出峰4为D-甘露糖、峰7为鼠李糖、峰10为D-葡萄糖醛酸、峰12为D-半乳糖醛酸、峰13为D-无水葡萄糖、峰14为半乳糖、峰16为阿拉伯糖。色谱图见图3。

图1 6批芫根药材高效液相色谱叠加指纹图谱Fig.1 HPLC overlay fingerprints of six batches of Brassica rapa

4.D - 甘露糖 7.鼠李糖 10.D - 葡萄糖醛酸 12.D - 半乳糖醛酸 13.D - 无水葡萄糖 14.半乳糖 16.阿拉伯糖图3 芜根药材高效液相色谱对照指纹图谱4.D - mannose 7.Rhamnose 10.D - glucuronic acid 12.D - glucuronic acid 13.D - anhydrous glucose 14.Galactose 16.ArabinoseFig.3 HPLC reference fingerprint of Brassica rapa

2.2.4 相似度评价

以6 批芫根药材样品生成的共有模式为对照指纹图谱，计算各批间的相似度［20］，结果相似度为0.946～1.000，表明不同批次的芫根药材多糖化学成分具有一致性，组成多糖的单糖成分相同。详见表3。

表3 6批芫根药材指纹图谱相似度评价结果Tab.3 Evaluation results of similarity in fingerprints of six batches of Brassica rapa samples

3 讨论

芫根生长于3 500 m 以上的高海拔地区，主产于西藏的曲水、昌都等地，本研究中收集的药材样品来自西藏拉孜县、聂拉木县、曲水县、山南市、昌都市5个地区，这些地区平均海拔均超过3 500 m，能代表高原芫根的高海拔产地的特征。

芫根中含有总多糖、黄酮、多酚等成分，多糖为芫根中的主要活性成分，具有抗缺氧、抗辐射、提高免疫力等作用［21-23］。多糖是由多个单糖缩合而成的生物大分子物质，常以糖苷键线性或分枝链接而成，如枸杞、黄芪、灵芝等中药的有效活性成分均为多糖。测定多糖含量的方法主要有紫外分光比色法、高效液相色谱法、酶法等，目前常用苯酚- 硫酸紫外分光比色法［24-25］，其原理是多糖在浓硫酸作用下水解成单糖，迅速脱水生成糠醛衍生物，与苯酚缩合成有色化合物，该方法操作简单快速，重复性好，显色后供试品溶液稳定性好。前期试验中，采用蒽酮-硫酸法测定总多糖含量，但供试品溶液稳定性较差，可能与样品中的蛋白质对显色反应有干扰相关［26］。故本研究中采用苯酚-硫酸紫外分光比色法测定总多糖含量，将对照品溶液进行全波长扫描，扫描范围为200～800 nm，结果对照品溶液于484 nm 波长处有最大吸收，故检测波长确定为484 nm。同时，本研究中通过单糖的高效液相色谱指纹图谱分析发现，D- 无水葡萄糖的含量约为60%，故选择D-无水葡萄糖为标准对照品。

中药指纹图谱是选取其中某些重要的特征信息作为控制中药质量的重要鉴别手段，具有整体性、特征性及可量化的特点，是一种有效的质量控制方式。PMP 在碱性条件下可与单糖定量缩合成PMP - 单糖衍生物，该物质相对稳定，于250 nm 波长处有强光吸收，故以PMP 为衍生试剂。通过高效液相色谱法比较不同产地西藏芫根药材中单糖的指纹图谱，共识别出19 个共有峰，并指认出7 个特征峰，初步分析出芫根多糖由D-无水葡萄糖、D-甘露糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D- 葡萄糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖7 种单糖构成，进一步明确了西藏芫根多糖中单糖的分布规律，为其多糖结构分析和质量控制提供了依据。

本研究中建立的方法操作简便、结果稳定可靠，可用于西藏芜根中总多糖的质量控制与评价。