奥美拉唑抑制miR-214-3p介导自噬提高上皮性卵巢癌细胞对顺铂的敏感性*

蔡 文, 季维雪, 肖 兰, 江飞云△, 陈文刚, 陶云松

华东师范大学附属芜湖医院(芜湖市第二人民医院) 1妇科 4药剂科,芜湖 241001 2中国科学技术大学附属第一医院妇产科,合肥 230022 3皖南医学院第二附属医院药剂科,芜湖 241001

卵巢癌是女性生殖系统中最致命的恶性肿瘤,在全球女性肿瘤相关死亡率中居首[1]。目前已有多项研究发现在卵巢癌组织中存在多种miRNA表达异常,其中miR-214作为重要分子枢纽之一参与肿瘤网络调控[2]。miR-214经由Dicer酶环状前体剪切后分为miR-214-3p以及miR-214-5p,多数情况下miR-214-3p在肿瘤中表达下调,发挥抑癌基因作用。卵巢癌是预后最差的妇科恶性肿瘤,因其极易发生化疗耐药和复发转移,晚期患者5年生存率仅为30%,临床治疗失败往往归因于肿瘤细胞多药耐药,研究发现miR-214-3p作为肿瘤抑癌基因可能参与调节肿瘤细胞的多药耐药[3-4]。最新研究表明,肿瘤细胞的保护性自噬与肿瘤细胞增殖及耐药等密切相关[5-6]。而在多项来自体外细胞实验的结果中,我们看到应用质子泵抑制剂(proton pump inhibitors,PPIs)做预处理后,可通过抑制肿瘤耐药细胞保护性自噬,从而使肿瘤细胞对化疗药物敏感性提高[7-8]。

本研究拟从组织水平检测miR-214-3p和自噬蛋白p62表达并分析两者关系,细胞水平探讨奥美拉唑(omeprazole,OME)对miR-214-3p介导自噬的抑制及对上皮性卵巢癌细胞顺铂(DDP)敏感性的影响,为质子泵抑制剂应用于肿瘤化疗提供进一步的基础理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及细胞株

人卵巢癌顺铂敏感株OV2008和顺铂耐药细胞株C13K为本实验室收集保存。所用顺铂均购于山东齐鲁制药有限公司;艾司奥美拉唑注射液由阿斯利康制药公司购得;SYBR Green Master Mix由TaKaRa公司购得;反转录试剂盒由TaKaRa公司购得;p-gp抗体由英国Santa Cruz公司购得;p62及LC3-B抗体由美国Cell Signal公司购得;CCK-8检测试剂盒购于上海碧云天公司;蛋白酶k由上海翊圣生物科技有限公司购得;U6引物由上海吉玛公司购得;miR-214-3p茎环引物由上海吉玛公司购得,MDR1引物则由上海生工公司合成提供,相关序列见表1。

表1 miR-214-3p、MDR1及U6引物序列Table 1 miR-214-3p,MDR1 and U6 primer sequences

1.2 患者资料

选取2015年1月至2018年12月期间在华东师范大学附属芜湖医院(芜湖市第二人民医院)行手术治疗的43例上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)患者的病理标本(每例患者术前均未接受相关治疗)。患者年龄(50.27±6.36)岁,术后均接受化疗。按照卵巢癌FIGO的分期标准行手术病理分期,43例患者中Ⅰ～Ⅱ期12例,Ⅲ～Ⅳ期31例。所有标本收集均获得患者知情并签订知情同意书,并得到医院伦理委员会批准,43例患者均术后持续跟踪调查患者情况,根据患者的无进展生存期(progression free survival,PFS),将患者分类为铂敏感组(PFS≥12个月)和铂相对耐药组(包括铂部分敏感:12个月>PFS>6个月;铂耐药组:PFS≤6个月)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及干预分组 在5% CO2浓度、饱和湿度及37 ℃培养条件下,用含10%小牛血清1640培养液,将C13K和OV2008细胞孵育培养;设空白对照组、顺铂组及顺铂+大剂量OME(150 μmol/L)预处理组(顺铂+OME组),OME(150 μmol/L)预处理时间为24 h,之后顺铂再行处理24 h。

1.3.2 CISH法检测miR-214-3p水平 组织标本采用10%甲醛溶液固定、石蜡包埋,切片厚度为4μm。经脱蜡和水化处理,再用蛋白酶k(10 μL/mL)消化和脱水,用0.2%甘氨酸,4%多聚甲醛去除蛋白质后,置于杂交溶液中,60 ℃下预杂交2 h,然后加入DIG标记的miRCURYLNA探针(EXIQON),60 ℃下杂交16 h。洗涤处理后,4 ℃下孵育抗DIG-AP Fab片段(Roche)并过夜,第2天用含吐温-20的磷酸盐缓冲液冲洗,再用碱性磷酸酶显色液处理直至显色,再水洗残液,用乙醇脱水,封片,再用苏木精复染,最后采用中性树胶封片。

1.3.3 p62蛋白检测 采用免疫组织化学法,先将切片进行抗原修复,然后给予脱蜡、脱二甲苯、3% H2O2封闭,并给予枸橼酸修复液微波修复,4 ℃下,一抗p62(1∶1000)孵育过夜,第二天复温后,37 ℃下抗兔二抗(1∶2000)孵育30 min,PBS冲洗3次,每次5 min,随后在显微镜下加5% DAB显色。再给予苏木精复染、乙醇化、脱水和中性树胶封片,并置于室温风干。将切片放在光镜下观察,每例均随机观察10个高倍视野,细胞质中找到棕褐色细颗粒视为p62蛋白表达阳性细胞。

1.3.4 CCK-8检测细胞对顺铂IC50以1×104/mL细胞浓度铺96孔板,每孔100 μl细胞悬液,每组设5个复孔,继续培养24 h。然后去除培养液,用DDP(0～200 μmol/L)培养24 h后。置于新鲜培养液,同时加入10 μL的CCK-8,继续培养4 h,然后在450 nm波长检测各孔细胞吸光度值(A)平均值,根据公式:抑制率(%)=(1—实验组A值/对照组A值)×100%,计算出细胞生长抑制率,再根据抑制率计算CCK-8检测细胞对顺铂的IC50。

1.3.5 qRT-PCR检测miR-214-3p、MDR1 mRNA水平 实验进行3次,每次均以RNA试剂盒提取细胞RNA,反转录合成cDNA。以U6为内参照,每组设3个复孔,在ABI7300反应平台上进行PCR反应,以2-ΔΔCt法计算各组细胞中miR-214-3p、MDR1相对表达量。

1.3.6 免疫印迹法检测 取30 μg蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳,转至硝酸纤维素膜上;室温封闭2 h,用含0.05%吐温-20的TBS缓冲液(TBST)漂洗10 min,重复3次;加入相应p-gp一抗(1∶800)及p62一抗(1∶1000),4℃下孵育过夜。TBST再次漂洗3次后加入相应辣根过氧化物酶标记二抗(1∶10000),37℃下摇床温育2 h,实验结果用图像处理软件Image J统计分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 EOC组织中miR-214-3p及p62表达

结果显示,miR-214-3p在铂相对耐药EOC中表达低于铂敏感EOC[(0.67±0.32)vs.(1.53±0.82),(P<0.05)],相反,p62在铂相对耐药EOC中表达明显高于铂敏感EOC[(3.23±0.48)vs.(0.23±0.12),(P<0.01)],见图1。

A:miR-214-3p在铂敏感EOC中表达;B:miR-214-3p在铂相对耐药EOC中表达;C:p62在铂敏感EOC中表达;D:p62在铂相对耐药EOC中表达

2.2 EOC中miR-214-3p表达与p62表达的相关性分析

原位杂交免疫组化结果显示,30例铂敏感EOC组织中有20例呈miR-214-3p阳性,而13例铂相对耐药EOC组织中仅3例为miR-214-3p阳性;26例EOC中p62表达阳性,其中6例为铂敏感EOC,20例为铂相对耐药EOC。miR-214-3p在铂敏感EOC中表达较高,而在铂相对耐药EOC中表达低;相反,p62在铂敏感EOC中表达较低,而在铂相对耐药EOC中表达高。Pearson相关分析显示miR-214-3p和p62在EOC组织中表达量呈负相关(r=-0.387,P=0.005),见表2。

表2 EOC组织miR-214-3p与p62蛋白表达量的关系Table 2 Relationship between miR-214-3p and p62 protein in EOC tissue

2.3 CCK-8法检测细胞对顺铂药物IC50

OV2008和C13K细胞对顺铂的IC50分别为(27.82±0.76)μmol/L、(96.18±2.52)μmol/L,OME(150 μmol/L)预处理后,OV2008及C13K细胞对顺铂IC50均有不同程度降低,分别为(18.46±0.63)μmol/L、(30.18±1.07)μmol/L,尤以顺铂耐药株C13K更为显著(P<0.01),提示细胞对顺铂敏感性明显提高。

2.4 各组OV2008及C13K细胞中miR-214-3p及MDR1 mRNA表达

实时定量PCR显示OV2008中miR-214-3p mRNA表达水平高于C13K,表达水平为(0.975±0.073)和(0.074±0.015)(P<0.01);C13K中MDR1 mRNA表达水平高于OV2008,表达水平为(7.940±1.120)vs.(0.926±0.090)(P<0.01),差异有统计学意义。miR-214-3p mRNA在OV2008和C13K细胞顺铂组及顺铂+OME组分别为(0.121±0.030)、(0.402±0.089)和(0.007±0.001)、(0.024±0.007),与OV2008及C13K空白对照组比较,差异有统计学意义(均P<0.01)。OV2008和C13K细胞顺铂组及OME+顺铂组中MDR1 mRNA分别为(2.090±1.520)、(1.160±0.610)和(27.840±8.160)、(11.520±2.510),与OV2008及SKOV3空白对照组比较,差异有统计学意义(均P<0.01)。

2.5 各组OV2008及C13K细胞中p-gp及p62蛋白表达

顺铂敏感株OV2008中p-gp及p62表达均较顺铂耐药株C13K中的水平为低。顺铂作用后,C13K及OV2008细胞中p-gp及p62蛋白水平均有所上升;OME(150 μmol/L)预处理后,在相同浓度顺铂作用下,C13K及OV2008细胞中p-gp及p62蛋白水平均下降,尤以顺铂耐药株C13K更为显著(均P<0.05),见图2。

1:OV2008空白对照组;2:OV2008顺铂组;3:OV2008顺铂+OME组;4:C13K空白对照组;5:C13K顺铂组;6:C13K顺铂+OME组

3 讨论

改善化疗耐药是临床上肿瘤患者治疗的关键,部分临床常用非细胞毒性药物作为增敏剂,可改善化疗药物疗效或逆转肿瘤对化疗药物耐药性。质子泵抑制剂(PPIs)作为抑酸药物,主要用于治疗酸相关性疾病。近期有研究发现PPIs可抑制肿瘤细胞存活、转移和化疗耐药性,并影响食管癌中耐药相关miRNA表达[9]。miR-214-3p可通过抑制自噬增强结直肠癌的放射敏感性[10]。另有研究则证实miR-214-3p可通过抑制自噬增加乳腺癌细胞对三苯氧胺和富尔韦司特的敏感性[11],以上研究结果均提示miR-214-3p对自噬有一定调控作用,而关于PPI是否通过抑制miR-214-3p调控的自噬实现增敏,国内外均无报道,有必要深入研究。

本研究中43例EOC组织中miR-214-3p阳性表达率为53.5%,铂相对耐药EOC中miR-214-3p表达低于铂敏感EOC,提示miR-214-3p与卵巢癌铂耐药相关,与国内外学者报道一致[12-13]。p62蛋白在细胞自噬过程中起到分子调节器的作用,亦是反映自噬活性的标记蛋白之一[14]。p62高表达还是卵巢癌进展的重要危险因素[15]。多项研究显示,铂耐药的卵巢上皮癌细胞内p62水平明显增高[16]。我们的研究发现与miR-214-3p表达相反,p62在铂敏感EOC中表达较低,而在铂相对耐药EOC中表达高,miR-214-3p和p62表达呈明显负相关,miR-214-3p与p62水平与卵巢癌铂类药物的治疗反应相关。

人卵巢癌细胞株OV2008及C13K经DDP处理后,两株细胞中p62蛋白较空白对照组显著增加,miR-214-3p相对表达下降,表明DDP能诱导人卵巢癌细胞自噬。OME是第二代PPI,本课题组前期研究已发现OME预处理可抑制V-H+-ATP酶表达使细胞内pH值降低,逆转细胞内外pH梯度,同时抑制Yes相关蛋白(YAP)介导的自噬,从而提高人卵巢癌细胞对紫杉醇敏感性[7]。本研究体外细胞实验结果提示OME(150 μmol/L)预处理可使C13K及OV2008细胞对DDP敏感性增加,细胞中miR-214-3p相对表达明显升高、MDR1在蛋白及mRNA水平表达降低、p62蛋白表达下降,与空白对照组比较差异显著,进一步验证了OME可能是一种潜在的肿瘤耐药细胞的逆转剂。

综上可见,miR-214-3p在EOC细胞中低表达,且与铂耐药有关。OME预处理可提高人卵巢癌细胞对DDP的敏感性,其机制可能与抑制miR-214-3p调控的自噬有关,同时为PPIs类药物作为高效低毒性的化疗增敏剂提供了一定的实验证据。