LINC00115靶向miR-874-3p调控肝癌细胞生物学行为以及紫杉醇敏感性*

2024-04-11 08:41刘杨从
关键词:细胞系紫杉醇敏感性

王 威, 夏 辉, 周 程, 刘杨从, 戴 斌△

华中科技大学同济医学院附属武汉中西医结合医院,武汉市第一医院 1肝胆外科 2药学部,武汉 430022

肝癌是全球癌症致死的第三大原因,每年导致约83万人死亡[1]。手术切除对早期肝癌有效,化疗是延长中晚期肝癌患者生存期的重要手段,但术后复发转移频繁,预后并不理想。紫杉醇是新型抗微管药物,其通过抑制细胞有丝分裂在卵巢癌、乳腺癌中疗效显著,但其对肝癌有效性一般,这主要与肝癌对紫杉醇耐药有关[2-3]。探讨肝癌转移和紫杉醇抗性的潜在机制对增加紫杉醇敏感性、抑制肝癌进展具有重要价值。长链非编码RNA(lncRNA)不具备编码蛋白质能力,其通过转录激活、吸附miRNA、结合蛋白、或编码小肽等多种方式调控细胞功能[4]。lncRNA表达失调已被证实与肝癌细胞的持续增殖、凋亡抵抗、血管形成、化疗耐药、异常侵袭有关[5]。结直肠癌中LINC00115表达上调,并通过促进癌细胞侵袭、抑制凋亡促进结肠癌进展[6]。LINC00115通过靶向miR-200s促进胶质瘤干细胞样细胞自我更新和致瘤性[7]。但LINC00115在肝癌中的生物学作用未见报道。miR-874-3p是一种肝癌抑制因子,miR-874-3p下调与肿瘤细胞分化较差、分期较晚和患者预后较差有关[8]。miR-874-3p能够抑制上皮性卵巢癌细胞的增殖、转移和紫杉醇耐药[9]。生物信息学预测显示miR-874-3p是LINC00115的潜在靶点,据此本研究探讨LINC00115靶向miR-874-3p在肝癌中的作用。本研究通过检测LINC00115、miR-874-3p在肝癌组织、细胞系中的表达情况,分析其对肝癌细胞生物学行为和紫杉醇敏感性的影响,揭示LINC00115对miR-874-3p的靶向调控作用,旨在为肝癌治疗提供潜在可用靶点。

1 材料与方法

1.1 肝癌组织和细胞系

在2019年1月至2019年12月收集被诊断为肝癌且在武汉市第一医院接受手术治疗的43例肝癌患者(男29例,女14例,年龄48~71岁,平均年龄56岁)的肝癌组织和匹配癌旁组织(非癌组织)。排除术前接受抗肿瘤治疗患者、既往癌症史者以及未签署书面知情同意书的患者。所有样品在使用前均保存在液氮中。所有程序均符合《赫尔辛基宣言》指导原则。

肝癌细胞系MHCC-97H、Hep3B、SK-HEP-1以及人肝永生化细胞THLE-3购自美国ATCC公司。

1.2 主要试剂

RNeasy Plus Mini试剂盒购自北京天根生化公司;PrimeScriptTM逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq购自大连TaKaRa公司;重组荧光素酶报告质粒、si-RNA、miRNA模拟物、anti-miRNA、pcDNA购自苏州迅捷生物公司;紫杉醇(纯度99.9%)购自上海研生生化试剂有限公司;CCK-8溶液、放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液购自上海碧云天生物公司;多药耐药蛋白1(MRP1)兔多抗(pro_39022)购自北京世联博研生物公司;羊抗兔IgG二抗(ab205718)、基质金属蛋白酶2(MMP2)兔多抗(ab97779)、MMP9兔多抗(ab38898)、β肌动蛋白(β-actin)兔多抗(ab16039)购自上海艾博抗公司。

1.3 qRT-PCR检测LINC00115和miR-874-3p表达

用RNeasy Plus Mini试剂盒分离总RNA,用PrimeScriptTM逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA,用SYBR Premix Ex Taq进行qRT-PCR。LINC00115和miR-874-3p表达水平用2-ΔΔCt方法计算。LINC00115引物上游5′-TGGCTTGTCTT-CCATCGTCC-3′,下游5′-GCACGAGGGTTGTT-ACAGGA-3′;β-actin引物上游5′-GGGAAATCG-TGCGTGACATTAAG-3′,下游5′-GTCAGGCA-GCTCGTAGCTCT-3′;U6引物上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGA-ATTTGCGT-3′;miR-874-3p引物上游5′-GAAC-TCCACTGTAGCAGAGATGGT-3′,下游5′-CAT-TTTTTCCACTCCTCTTCTCTC-3′。

1.4 细胞培养和实验分组

MHCC-97H、Hep3B、SK-HEP-1以及THLE-3细胞接种在添加10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液,放入37℃、含5% CO2培养箱中孵育。将MHCC-97H细胞接种到6孔板,细胞密度为1×104个/孔,用脂质体3000将40 nmol/L的寡核苷酸或0.4 μg质粒分别转染50%汇合的细胞,分为对照(NC)组、si-NC组、si-LINC00115组、miR-NC组、miR-874-3p组、pcDNA组、pcDNA-LINC00115组、anti-miR-NC+si-LINC00115组、anti-miR-874-3p+si-LINC00115组,通过qRT-PCR检测转染48 h细胞中LINC00115或miR-874-3p表达,随后进行下一步实验。

1.5 CCK-8法检测细胞活力和对紫杉醇的IC50值

细胞活力测定:将转染细胞以1×103个/孔接种到96孔板,并在37°C培养箱孵育48 h,更换为含10% CCK-8溶液的培养液。通过酶标仪在450 nm处检测吸光度(A)值。

IC50值测定:将转染细胞以1×103个/孔接种到96孔板,分别用不同浓度(1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L)的紫杉醇处理细胞48 h,更换为含10% CCK-8溶液的培养液。通过酶标仪在450 nm处检测吸光度(A)值,绘制量效曲线,计算IC50值。

1.6 Transwell法检测细胞迁移和侵袭

用不含FBS培养液将转染细胞悬浮并稀释至1×105个/mL的密度,取200 μL加入带有(用于侵袭)或不带有(用于迁移)基质胶的Transwell上室。将小室置于24孔板,加入600 μL含FBS的培养液。37℃孵育24 h后,擦去上室内细胞,分别用4%多聚甲醛固定,0.1%结晶紫染色。在显微镜下计数随机5个视野细胞总数,取均值表示侵袭细胞数。

1.7 Western blot检测MRP1、MMP2和MMP9蛋白水平

收集转染细胞,加入RIPA缓冲液提取总蛋白。制备分离胶和浓缩胶,将样品以每道30 μg添加到凝胶孔中。在80 V(浓缩胶)、120 V(分离胶)进行电泳直到溴酚蓝到达凝胶边缘。将蛋白湿转至PVDF膜,随后用5%脱脂奶粉封闭2 h,然后与一抗4℃孵育12 h。用PBS洗膜后,将膜与二抗在室温下孵育2 h。将增强型化学发光显影剂A和B以等体积混合并滴加到PVDF膜进行曝光和成像。Image J软件测定MRP1、MMP2和MMP9条带及β-actin条带的灰度值。

1.8 双荧光素酶报告基因实验

将包含野生型(WT)或突变型(MUT)miR-874-3p结合位点的LINC00115片段分别克隆到pGL4荧光素酶报告载体,构建重组载体WT-LINC00115、MUT-LINC00115。将以上重组载体分别与miR-874-3p模拟物或miR-NC分别转染到MHCC97H细胞中,在转染48 h后测定细胞相对荧光素酶活性。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 肝癌组织中LINC00115和miR-874-3p表达情况

肝癌组织中LINC00115表达水平显著高于癌旁组织[(2.94±0.31)vs.(1.00±0.13),P<0.05],miR-874-3p表达水平显著低于癌旁组织[(0.46±0.06)vs.(1.00±0.14),P<0.05]。

2.2 肝癌细胞系中miR-874-3p和LINC00115的表达情况

与人肝永生化细胞THLE-3比较,肝癌细胞系(MHCC97H、Hep3B、SK-HEP-1)中LINC00115表达水平显著升高(均P<0.05),miR-874-3p表达水平显著降低(均P<0.05),见表1。

表1 肝癌细胞系中miR-874-3p和LINC00115的表达情况Table 1 Expression of miR-874-3p and LINC00115 in liver cancer cell

2.3 下调LINC00115表达对肝癌细胞MHCC97H增殖、迁移、侵袭以及紫杉醇敏感性的影响

与si-NC组比较,si-LINC00115组MHCC97H细胞LINC00115表达水平、A值、迁移数、侵袭数、对紫杉醇IC50值以及MRP1、MMP2和MMP9蛋白水平显著降低(均P<0.05),见图1和表2。

图1 Western blot检测MMP2、MMP9、MRP1蛋白表达Fig.1 The protein expressions of MMP2,MMP9 and MRP1 detected by Western blotting

表2 下调LINC00115表达对肝癌细胞MHCC97H增殖、迁移、侵袭以及紫杉醇敏感性的影响Table 2 Effects of downregulation of LINC00115 on proliferation,migration,invasion and paclitaxel sensitivity of liver cancer cell

2.4 上调miR-874-3p表达对肝癌细胞MHCC97H增殖、迁移、侵袭以及紫杉醇敏感性的影响

与miR-NC组比较,miR-874-3p组MHCC97H细胞miR-874-3p表达水平显著升高(P<0.01),A值、迁移数、侵袭数、对紫杉醇IC50值以及MRP1、MMP2和MMP9蛋白水平显著降低(均P<0.01),见图2和表3。

图2 Western blot检测MMP2、MMP9、MRP1蛋白表达Fig.2 The protein expression of MMP2,MMP9 and MRP1 detected by Western blotting

表3 上调miR-874-3p表达对肝癌细胞MHCC97H增殖、迁移、侵袭以及紫杉醇敏感性的影响Table 3 Effects of upregulation of miR-874-3p on proliferation,migration,invasion and paclitaxel sensitivity of liver cancer cell

2.5 LINC00115靶向调控miR-874-3p表达

LncBase Predicted V.2预测到miR-874-3p与LINC00115序列存在互补位点,见图3。miR-874-3p模拟物和WT-LINC00115共转染与miR-NC和WT-LINC00115共转染比较细胞活力显著降低[(0.47±0.04)vs.(1.00±0.11),P<0.05];miR-874-3p模拟物和MUT-LINC00115共转染与miR-NC和MUT-LINC00115共转染比较差异无统计学意义[(1.02±0.11)vs.(1.00±0.10),P=0.692]。pcDNA-LINC00115组MHCC97H细胞LINC00115表达水平显著高于pcDNA组[(2.48±0.21)vs.(1.00±0.08),P<0.05],miR-874-3p表达水平显著低于pcDNA组[(0.48±0.04)vs.(1.00±0.10),P<0.05];si-LINC00115组MHCC97H细胞LINC-00115表达水平显著低于si-NC组[(0.43±0.04)vs.(1.01±0.12),P<0.05],miR-874-3p表达水平显著高于si-NC组[(1.96±0.17)vs.(0.99±0.10),P<0.05]。

图3 LncBase Predicted V.2对LINC00115和miR-874-3p结合进行预测示意图Fig.3 The combination of LINC00115 and miR-874-3p predicted by LncBase Predicted V.2

2.6 下调miR-874-3p可以逆转LINC00115低表达对肝癌细胞MHCC97H增殖、迁移、侵袭以及紫杉醇敏感性的影响

与anti-miR-NC+si-LINC00115组比较,anti-miR-874-3p+si-LINC00115组MHCC97H细胞miR-874-3p表达水平显著降低(P<0.01),A值、迁移数、侵袭数、对紫杉醇IC50值以及MRP1、MMP2和MMP9蛋白水平显著升高(均P<0.01),见图4和表4。

1:anti-miR-NC+si-LINC00115;2:anti-miR-874-3p+si-LINC00115

表4 下调miR-874-3p可以逆转LINC00115低表达对肝癌细胞MHCC97H增殖、迁移、侵袭以及紫杉醇敏感性的影响Table 4 Downregulation of miR-874-3p can reverse the effects of low LINC00115 expression on proliferation,migration,invasion and paclitaxel sensitivity of MHCC97H

3 讨论

肝癌是一种侵袭性恶性肿瘤,由于其复发率高、转移和化疗耐药频繁,现在的临床治疗效果总是不尽如人意。目前研究表明lncRNA表达异常与肝癌发生有关,其可调节肝癌细胞生物学行为和化疗敏感性,是抑制肝癌进展的理想靶点[5]。研究发现LINC00115参与乳腺癌的转移,其高表达预示预后较差[10]。下调LINC00115通过抑制肺癌上皮间质转化从而阻碍癌细胞迁移和侵袭[11]。本研究检测到LINC00115在肝癌组织、细胞系中表达增加,下调LINC00115表达显著降低肝癌细胞活力,减少迁移和侵袭数,同时伴随着促转移因子MMP2和MMP9水平降低,表明LINC00115在肝癌中扮演致癌基因角色,下调LINC00115可能是抑制肝癌细胞恶性行为的重要策略。肿瘤细胞通过耐药对化疗药物失去反应性,这是肿瘤复发和转移的关键,最终导致肿瘤治疗失败。MRP1是药物外排转运蛋白,其广泛表达参与多种癌细胞的化疗耐药性[12-13]。本研究中下调LINC00115表达可降低肝癌细胞对紫杉醇的IC50值,降低MRP1蛋白水平,表明下调LINC00115表达可提高肝癌细胞对紫杉醇的敏感性。

lncRNA可作为分子海绵与miRNA结合,导致miRNA靶基因重新激活从而发挥生物学功能[14]。据报道,LINC00115通过与miR-30a结合上调SOX9促进卵巢癌干细胞的干性并抑制凋亡[15]。本研究检测到miR-874-3p在肝癌组织、细胞系中表达下降,并证实miR-874-3p是LINC00115的直接靶点。研究表明miR-874-3p表达水平与食管鳞癌的淋巴结转移及临床分期之间有关联,miR-874-3p低表达是食管鳞癌预后不良的重要因素[16]。miR-874-3p通过下调靶基因调节剂G蛋白4(RGS4)水平抑制骨肉瘤细胞增殖和转移[17]。另有研究表明miR-874-3p还可作为TP73-AS1、DANCR、MCF2 L-AS1等lncRNA的下游靶miRNA,介导敲低lncRNA表达对视网膜母细胞瘤、三阴性乳腺癌、结直肠癌细胞恶性表型的抑制作用[18-20]。本研究证实上调miR-874-3p表达可降低肝癌细胞活力,下调MMP2、MMP9、MRP1蛋白表达,抑制细胞侵袭和迁移,并提高其对紫杉醇的敏感性。由于上调miR-874-3p表达和下调LINC00115表达对肝癌细胞的紫杉醇增敏以及抗增殖、抗迁移和抗侵袭效应一致,LINC00115靶向负调控miR-874-3p表达,这提示肝癌中可能存在LINC00115/miR-874-3p分子轴。下调miR-874-3p表达显著减弱LINC00115低表达对肝癌细胞活力、迁移、侵袭和紫杉醇敏感性的影响,这表明下调LINC00115通过促进miR-874-3p表达来抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭行为,增加其对紫杉醇的敏感性。本研究主要局限性是并未对miR-874-3p下游靶基因进行探索,这将是下一步研究的重点。

综上,肝癌中LINC00115表达上调,miR-874-3p表达下调。下调LINC00115通过促进miR-874-3p表达来抑制肝癌细胞恶性生物学行为,并提高其对紫杉醇的敏感性。因此,靶向抑制LINC00115/miR-874-3p分子轴可能是抑制肝癌进展、逆转肝癌紫杉醇耐药的潜在有效策略。

猜你喜欢
细胞系紫杉醇敏感性
钇对Mg-Zn-Y-Zr合金热裂敏感性影响
紫杉醇脂质体与紫杉醇不同途径灌注治疗兔舌癌的疗效研究
脂质体紫杉醇周疗方案与普通紫杉醇治疗乳腺癌的疗效及不良反应比较
AH70DB钢焊接热影响区组织及其冷裂敏感性
STAT3对人肝内胆管癌细胞系增殖与凋亡的影响
护理干预对预防紫杉醇过敏反应疗效观察
如何培养和提高新闻敏感性
抑制miR-31表达对胰腺癌Panc-1细胞系迁移和侵袭的影响及可能机制
E3泛素连接酶对卵巢癌细胞系SKOV3/DDP顺铂耐药性的影响
微小RNA与食管癌放射敏感性的相关研究