抗菌肽的来源与作用机理及应用

宋雪莹,高圣玥,李 平,李 静,宋 岩,佟桂芝

(1.黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院,黑龙江齐齐哈尔 160000;2.黑龙江省鹤岗市农业综合服务中心,黑龙江鹤岗 154100)

20世纪40年代是微生物学和药物发展的重要时期,青霉素是第一种用于临床的抗生素[1]。在随后的50年里,由细菌介导的传染病得到有效控制。然而,由于抗生素的过度使用和误用,耐药菌株数量逐渐增加,使一些传统药物失效。因此,研发替代抗生素药物已迫在眉睫。

抗菌肽广泛存在于自然界,是先天免疫系统对抗病原体的有效手段[2]。抗菌肽大多呈阳离子和两亲性,可通过破坏细胞膜结构或抑制病毒组装来杀死病原体[3]。此外,抗菌肽可通过调控免疫因子,增强机体免疫力,被认为是替代抗生素的潜能药物。

1 抗菌肽的来源

1.1 天然获得

抗菌肽最早在惜古比天蚕体内发现,随后在微生物、植物和动物体内均发现具有生物活性的小肽[4]。目前在抗菌肽数据库(http://aps.unmc.edu/AP/main.php )里收录了超3000种不同来源的多肽,多数来源于动物,其次为植物和微生物[5]。动物源性抗菌肽在哺乳动物、两栖动物类、爬行动物类、鱼类、鸟类、节肢动物类和昆虫等均有被发现[6]。植物源抗菌肽包括防御素类、硫素类、脂质转移蛋白类、环肽类、脱皮素类以及橡胶蛋白样肽等[7]。微生物来源的抗菌肽主要是来源于细菌的细菌素或肽类抗生素[8]。天然抗菌肽虽具有生物活性,但存在易被水解、稳定性差、溶血性高等缺点。

1.2 重组改造

以天然抗菌肽为模板,通过氨基酸替换、截短,多种肽间杂合,以及重头设计等方法可获得全新抗菌肽[9]。重组改造的抗菌肽较天然抗菌肽活性高、稳定性好、毒副作用小。重组改造抗菌肽一般分为4个步骤(图1):第一步,在抗菌肽数据里选定模板肽氨基酸序列;第二步,根据天然抗菌肽抗菌活性的标准预测具有潜力的抗菌肽序列,如正电荷至少为+1、疏水比40%～60%、伯曼指数≤2.5;第三步,利用生物信息学在线软件,对重组氨基酸序列理化性质进行预测,包括等电点、抗蛋白水解能力、分子质量、抗菌潜力、亲水性、疏水性;第四步,利用生物信息学在线软件,对重组氨基酸序列结构进行预测,包括α-双螺旋结构和3D结构[10]。

图1 抗菌肽重组改造步骤

2 作用机制

2.1 抗菌

抗菌肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌均具有抑制作用。由于微生物膜结构高度保守,均由磷脂(phospholipid,PL)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG)、双磷脂酰甘油(cardiolipins,CL)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)组成[11],而抗菌肽发挥生物活性的基础是与病原菌细胞膜间的相互作用[12]。抗菌肽中的阳离子残基与带负电荷的细菌膜表面结合,亲水基团插入脂质分子内,疏水基团指向膜外环境,形成离子通道,导致细胞膜破裂或质内物质外泄,进而杀灭细菌[13]。目前,被普遍认可的模型分为地毯模型、凝集模型、环孔模型和桶板模型。

2.2 抗病毒

抗菌肽可以直接作用于病毒颗粒或通过间接干预病毒生命周期的各个阶段去阻断病毒的感染。陈朝霞[14]研究家蝇抗菌肽Cecropin抗乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)的作用机制发现,抗菌肽 Cecropin直接作用于HBV颗粒,破坏其结构并发生凝集反应。进一步研究发现,抗菌肽Cecropin抑制HBV的黏附/进入及进入后阶段。另有研究发现,鱼类中抗菌肽Nk可通过抑制病毒与宿主细胞膜的融合发挥抗病毒特性[15]。

2.3 调控免疫因子

抗菌肽是先天免疫和适应性免疫之间相互作用的重要介质。抗菌肽编码序列的5＇端上游含有核因子κB(nuclear factor-κ-gene binding,NF-κB)、白细胞介素-6核表达因子(nuclear factor interleukin 6,NF-IL6)、急性期反应因子和γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)等转录因子,参与调节免疫系统中单核粒细胞防御素和上皮细胞脂多糖的合成表达[16]。这些研究表明抗菌肽可以通过参与先天性免疫和适应性免疫,激活或增强免疫反应,最终提升免疫功能。

3 临床上应用

3.1 抗病毒性疾病

病毒性疾病严重影响畜禽生长发育,且无特效药物,现多以预防为主。抗菌肽具有抗病毒作用,且在治疗多种病毒性疾病中应用。

寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是一种单链、包膜和正义RNA病毒,属于黄病毒科[17]。ZIKV感染可引起多种严重疾病,可导致公畜睾丸炎,影响精液品质,也会传播到仔畜,引发先天性畸形、神经系统障碍等[18]。从海蛇(Hydrophis cyanocinctus)中鉴定出的抗菌肽Hc-CATH具有抗ZIKV感染的作用,主要通过下调介导ZIKV感染的受体(AXL receptor tyrosine kinase,AXL)表达,从而降低宿主细胞对ZIKV的敏感性,并在小鼠和妊娠小鼠中显示出预防和治疗作用[19]。

抗菌肽对冠状毒属病毒也表现出显著的抑制作用。来源于人的防御素抗菌肽(human defensin-1,HNP1)可以结合严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)的Spike蛋白,抑制其与宿主细胞中血管紧张素转换酶-2 (angiotensin-converting enzyme 2,ACE-2)蛋白的结合,发挥抗病毒作用[20]。牛乳铁肽(LFcin B)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)等几种猪疾病病毒具有抗病毒活性[21]。

3.2 抗细菌性疾病

细菌感染是畜禽患病的主要传染源,耐药菌株的出现也给防治细菌性疾病带来新的挑战。研究发现,抗菌肽LL-37对多种细菌具有较高抑菌活性。抗菌肽LL-37来源于前体hCAP18蛋白的C端,以颗粒形式储存。其特有的正电荷可与带负电荷的细菌膜结合。在这种相互作用中,LL-37将自身转化为α-螺旋构象,从而导致膜渗透和细菌裂解。LL-37还直接或间接地对多种免疫细胞,特别是中性粒细胞发挥广泛的免疫调节作用[22]。如猪链球菌是一种全球分布的人畜共患病原体,与人类脑膜炎和败血症有关,抗菌肽LL-37通过直接穿透细菌膜和刺激中性粒细胞的免疫功能杀灭细菌。结核分支杆菌可感染动物和人肺部,不仅给畜牧养殖造成巨大的经济损失,而且会引发公共卫生问题。其中,10%的人结核病是由牛分支杆菌引发的[23]。有研究表明,抗菌肽LL-37及其合成的富含色氨酸的衍生肽可抑制分支杆菌的生长,在测试的最低浓度6.3 μmol/L下,LL-37对分支杆菌的生长抑制高达9.7%,其衍生肽对分支杆菌生长的抑制率为19.2%,呈剂量依赖性且对原代巨噬细胞毒性最小[24]。

3.3 抗癌症细胞

目前,抗菌肽抗癌症细胞的研究日益深入,已发现来源于两栖动物的抗菌肽Aurein 1.2、Caerin 1.1、Caerin 1.3、Caerin 1.5、Caerin 1.6、Caerin 1.7、Caerin 1.9、Caerin 1.10、Maculatin 1.3、Ascaphin-8、Figainin 2、Temporin A、Temporin B、Temporin G、Magainin 2,昆虫的抗菌肽Alloferon 1、Alloferon 2、Cecropin A、Melittin和人的抗菌肽Human1、Human2、Human3、LL-37、hBD3、hBD-1对肿瘤细胞均有抑制作用。

抗菌肽LL-37可以通过激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号导致线粒体功能障碍和活性氧产生积累,诱导DNA损伤和细胞周期阻滞,抑制胰腺癌的生长[25]。此外,LL-37能够诱导免疫抑制性骨髓源性抑制细胞和M2巨噬细胞的减少,以及肿瘤中抗癌效应T细胞的上调。LL-37也显示出对血液恶性肿瘤、胃癌、结肠癌、胶质母细胞瘤和口腔鳞状细胞癌的抗癌作用[26]。抗菌肽Ascaphin-8及其衍生肽进行人类癌细胞集落形成,结果表明该肽及衍生肽都表现出抑制人类癌细胞增殖的作用,衍生肽对人肺腺癌细胞系A549细胞的转移表现出更好的抑制作用[27]。抗菌肽Figainin 2在人乳腺癌细胞系MCF-7细胞和小鼠黑色素瘤细胞系B16F10细胞中表现出抗增殖活性,还可以激活人中性粒细胞中活性氧的产生[28]。抗菌肽Melittin通过增加caspase-3和caspase-9的激活,抑制磷脂酰肌醇3激酶和丝裂原活化蛋白激酶信号通路诱导细胞凋亡,还可抑制许多黑色素瘤细胞的生长、克隆存活、迁移和侵润。

4 结语

抗菌肽在抗菌、抗病毒、抗肿瘤细胞中均表现出较好的生物活性,但获批应用于临床中的种类有限。因抗菌肽使用、毒性、疗效、给药方法、宿主摄取以及抗菌肽在体内的反应的临床数据较少,还不足以指导抗菌肽发展成为治疗产品。虽以天然抗菌肽为模板,利用生物信息学手段可获得改造重组多肽,提高了活性和稳定性,降低了毒副作用。但多数研究尚处于试验室阶段,多为生物活性学研究,较少应用于临床应用阶段。因此,抗菌肽在临床中的开发与应用仍然任重道远。