多孔沸石混合填料BAF 废水脱氮及微生物研究

边佳

（安徽皖欣环境科技有限公司，安徽合肥230000）

1 引言

随着水体富营养化问题的日趋严重，各行各业对氮素排放的要求也愈加严格，因此，如何有效净化氮素成为当前废水处理领域的重要课题［1］。氮在废水中的存在方式多种多样，如氨态、分子态、有机态、硝态和亚硝态等［2］，其中，氨氮是引发水域富营养化的重要污染源之一。因此，开发一种经济高效的氨氮去除方法，以达到高标准的氮素排放要求，成为当前水处理研究的关键。

曝气生物滤池（BAF）融合了过滤、生物代谢、吸附等多种净化功能，在水处理应用中备受关注［3-4］。生物膜是BAF 稳定运行的关键，其中微生物活性对BAF 的处理效果影响较大。填料表面的结构和物化性质对附着物生长以及出水水质的提升至关重要；沸石作为廉价天然的非金属载体，具有独特的多孔结构、优异的离子吸附和交换性能［5］。通过对天然沸石载体进行改性或与其他材料联合，可以有效提升对氮素的去除水平，促进载体再生［6-8］。研究表明，不同填料载体上的微生物结构具有多样性，对氮素去除的作用机理也不尽相同，进水及工艺条件也在很大程度上影响了沸石填料的脱氮性能及微生物群落［9-10］。因此，在开发高效廉价的沸石填料的同时，探讨沸石填料中生物群落结构及演替变化规律对BAF 净化废水的工艺优化具有重要意义。

本文以天然沸石、铝粉、水泥为主要原料，制备了多孔沸石混合填料。通过吸附、生物再生、淋洗序批三段式BAF 技术，探究填料的氨氮去除性能及氨氮废水处理的最佳工艺参数；通过DNA 提取、PCR扩增、DGGE 电泳等方法分析了填料上微生物结构及多样性，旨在为BAF 废水处理的参数选取及工艺优化设计提供参考。

2 材料与方法

2.1 实验材料及分析测试方法

本研究采用的沸石矿物取自安徽省宣城水东镇，破碎后筛取至80～100 目。铝粉源自合肥市化学试剂有限公司，水泥从安徽省芜湖市的海螺水泥制造公司购买。筛取后的沸石、铝粉、水泥按照配比与水混合，搅拌浆液30 min，随后保持操作温度为60 ℃，将形成的浆液在模具中约3 h，以促使浆液中的气体释放并形成气泡，同时切割成边长约10 mm的正方体。将其在高压蒸汽锅中蒸压6 h 后，即可得到多孔沸石混合填料（Porous mixed zeolite filter）。本研究使用纳氏试剂分光光度法对实验出水的氨氮进行了检测，同时采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法和紫外分光光度法检测出水中亚硝酸盐氮和硝酸盐氮含量。

2.2 实验装置及脱氮水处理实验

图1 为多孔沸石混合填料氮素水处理装置，填料柱和填料高度分别为195 cm 和210 cm，内外层直径分别为8 cm 及10 cm。在填料装柱后，首先将活性污泥曝气、沉淀1 d，去除上清液后按照相同体积添加50 mg/L 的氨氮水溶液，继续通入空气从而对硝化细菌进行富集。随后将液体通入装置挂膜，通过每天取样监测出水氨氮及硝态氮，直至硝化率达90%以上后，通过BAF 技术进行吸附、生物再生、淋洗序批三段式处理。首先，通过调整蠕动泵的流量，使得水力停留时间分别为4.2，3.0，1.8 h，采用上流式的进水方式，将人工配置废水采用连续注入的方式通入填料柱中，依据国内城镇污水处理厂氨氮排放限值，以1.5 mg/L 的出水氨氮浓度作为停止进水的阈值，下一阶段通过排空填料柱中的水，使用空压机向填料柱鼓风供氧一段时间，停止进气后在反应体系顶部进行淋洗，以清洗由生物硝化生成的硝酸盐，收集淋洗液并监测其中氨氮、硝态氮及总氮浓度，随后计算各项去除率。

图1 实验装置设计

2.3 微生物群落分析方法

2.3.1 DNA 提取

本小节利用产自Omega 公司的E.N.Z.A DNA试剂盒对微生物群落的沉积物进行提取分析，具体步骤如下：首先取微生物沉积物样品于50 mL 离心管中，在9 000 r/min 下离心以去除水分。随后将样品（0.3～0.6 g）放入2 mL 的离心管中，添加1 mL 的Buffer SLX，并在最高速度下涡旋约3 min；向离心管中添加Buffer DS 100 μL 并均匀涡旋，在60 ℃下水浴约10 min，放入离心机中，室温下调节转速为3 000 r/min，持续5 min 后将上层澄清液移至另一离心管中；添加200 μL Buffer SP2，均匀涡旋后在5 ℃下冰浴5 min 并离心，将上层澄清液转移到800 μL 离心管，同时添加0.7 倍体积异丙醇，振荡均匀后在5 ℃下离心约8 min；将离心管取出，小心倒出上清液，并倒置离心管于滤纸上，维持约1 min；在65 ℃下添加200 μL Elution Buffer，同时水浴加热8 min，混匀后溶解DNA；添加100 μL HTR Reagent，均匀涡旋后室温下静置2 min，随后于4 ℃，10 000 r/min下离心2 min；将上清液转移到2 mL 离心管，并加入相同体积的Buffer XP2，均匀涡旋后将混合液转移至离心柱，于4 ℃，10 000 r/min 下离心1 min，弃滤出液；添加300 μL Buffer XP2，4 ℃进行离心，弃滤出液并添加700 μL SPW Wash Buffer；在4 ℃环境下，调节转速为10 000 r/min 离心1 min，弃滤出液（此步骤重复2 次）；在相同温度下，调节转速为13 000 r/min 离心3 min，将离心柱倒置于滤纸之上，维持约1 min；将离心柱移入新的离心管内，并在65 ℃下添加25 μL Elution Buffer，水浴静置约7 min；在4 ℃，12 000 r/min 下离心1 min，将DNA 洗脱，并将该步骤重复2 次。

2.3.2 PCR 扩增

PCR 的扩增制备完成于上海生工生物工程技术服务有限公司，以总DNA 为模板，扩增体系见表1。

表1 PCR-DGGE 扩增体系

引物序列见表2。

表2 PCR-DGGE 引物序列

扩增程序如图2 所示。

图2 PCR-DGGE 扩增流程（引物：F338-GC，518R）

在经过上述处理后，取出5 μL 的PCR 产物，首先和染料混合均匀（1 μL），通过1%琼脂糖凝胶电泳（80 V，1 h）进行检测；最终通过凝胶系统得到图谱并进行保存。

2.3.3 DGGE 电泳及分析方法

使用D-code 通用突变系统（DGGE 电泳系统，Bio-Rad 公司），用于分析检测PCR 产物。首先制备变形梯度凝胶，其中细菌变性剂的浓度在45%～55%之间，随后进行点样和变性梯度凝胶电泳；点样体积需为30 μL（包括25 μL 的PCR 产物和5 μL 染料），电泳过程条件设置为60 ℃，75 V，持续14 h；随后进行凝胶着色处理，通过紫外凝胶系统成像并对图谱进行保存；再使用灭菌刀片切割电泳过程中获得的特异条带，放入200 μL 的离心管里，加入40 μL 的蒸馏水后，将其放在冰箱内静置一晚；最后将混合液进行扩增并克隆测序。

运用Quantity One 及Python 软件分析图谱，在消除背景及噪声干扰后，使用Gaussian 模型可以获取泳道内各条带光密度和位置。对于图谱分析，相似度系数基于2%误差值进行区分匹配及计算。图谱中的每一个菌种或操作单元分布都对应着一个条带，因此，条带数量代表微生物群落的多样性。信号强弱一定程度反映该种属微生物数量，因此可通过条带数目及亮度得出沉积物中微生物群落结构［11］。利用凝胶电泳图像分析软件，可以测算出光吸收峰面积，进而得到每一个条带或泳道相对丰度以及微生物多样性指数，此外，还通过辛普森多样性指数、香农多样性指数、均匀度和丰富度等指标深入分析微生物群落多样性。

式中，H 代表香农多样性指数；Pi＝Ni/N，Ni代表样品中第i 条带的光密度值，N 为样品中所有条带的光密度总和。

式中，E 代表均匀度指数；S 为丰富度，即为每一泳道内条带数量［12-13］。

将测序获得序列与Genbank 基因库中测序序列加以比对，得到具有高度同源性的序列，进而使用邻接树方法来构造系统发育树（boot strap＝1 000），并进行相关的同源性比对分析。

3 结果与讨论

3.1 不同水力停留时间对多孔沸石混合填料的水处理效果影响

图3 为不同水力停留时间下多孔沸石混合填料氨氮去除性能，反应过程中硝酸盐氮浓度的上升归因于进水氨氮经混合填料微生物硝化作用（NO＝NO2--N+NO3--N）；总无机氮含量的降低则主要源于氨氮通过离子交换作用被去除（TN＝NH4+-N+NO2--N+NO3--N）。

图3 水力停留时间对氮素去除率的影响

下列公式分别表示了离子交换去除率、生物硝化去除率及氨氮去除率：

式中，Ci代表反应进水处含氮化合物浓度，mg/L；C代表反应出口处含氮化合物浓度，mg/L。

在不同水力停留时间下，多孔沸石混合填料均展现出优异的氨氮处理效果，在BAF 的吸附过程中，生物硝化与离子交换作用相互协同，使出水氨氮浓度保持在阈值以下，当多孔沸石填料逐渐吸附饱和，离子交换去除率逐渐降低。当水力停留时间为4.2 h 时，生物硝化和离子交换去除率随着天数的增加逐渐逼近，到了第8 天生物硝化去除率超过了离子交换去除率，这表明填料中生物硝化作用代替离子交换占据了主导作用，从而导致出水中NO2--N 和NO3--N 浓度的上升，同时总氮（TN）的去除率随之降低。而在水力停留时间为3.0 h 和1.8 h 时，多孔沸石填料在BAF 运行的第10～14 天及第15～17 天内的离子交换去除率始终高于生物硝化去除率，表明吸附阶段中氨氮去除仍以离子交换作用为主导。

进一步对氨氮容积负荷进行衡算可以发现，当反应体系的水力停留时间调节为4.2 h 时，氨氮的容积负荷为0.042～0.053 kgNH4+-N/（m3·d-1），氨氮去除率为82.3%～94.7%。然而随着水力停留时间的降低，氨氮的容积负荷增大，且其去除率可稳定在84.3%～91.8%，表明多孔沸石填料具有优异的抗冲击负荷能力及氨氮去除能力。随着水力停留时间的进一步降低，多孔沸石填料的容积负荷为0.097～0.100 kg NH4+-N/（m3·d-1），而氨氮去除率略有降低（82.5%～88.1%）。综合考虑水力负荷和氨氮去除，选取3.0 h 为多孔沸石填料吸附的最佳水力停留时间。

3.2 PCR－DGGE 结果分析

在序批式BAF 系统的运行过程中，其内部微生物群落也发生了相应变化。本实验选取了体系中6个不同高度（里外）填料进行PCR-DGGE 图谱分析，探究了不同填料层高度的微生物群落变化情况，具体分布情况如下：样品编号1 号和4 号分别为体系上层填料外部及内部分析；样品编号2 号和5 号分别为体系中层填料外部及内部分析；样品编号3 号和6号分别为体系下层填料外部及内部分析。

沸石填料系统的微生物群落多样性的变化情况如图4 所示，沸石填料系统上、中层的群落多样性相对更高。上层填料外部和内部样品（1 号、4 号）分别为25 和18 条，中层外部和内部样品（2 号、5 号）为24 和20 条，下层填料外部和内部样品（3 号、6 号）分别为21 和20 条。可见沸石填料系统外部的微生物多样性相对更高。其中，1，2，3，9，23，25，28 在填料系统各部位都能被观察到，为最主要的优势种群，表明这些条带代表的菌群生存适应能力更强；而这些条带信号也相对更强，表明菌群在系统中含量和活性较高，有利于有机污染物的去除。进一步讨论填料内外层多样性可以发现，沸石填料系统中外层样品的优势条带数量多于填料内层的样品，表明其多样性更高，而内层样品具有部分独有的优势条带，这主要归因于填料内部含有厌氧菌群落。

图4 不同填料层PCR-DGGE 图谱

如图5 所示，根据戴斯系数计算并分析样品间的相关性。将1 号样品设置为1.00。滤池上中下层微生物种属差异很小，表明填料系统内具有稳定的优势微生物群落和较强的抗负荷力。而系统内外优势菌群表现出一定差别，这主要是吸附过程中没有进行曝气处理，导致营养物质和溶解氧随水流方向逐渐下降，其中一些微生物不能适应营养不足的环境，而在该营养环境中能保持高活性的微生物得以保留，从而体现出一定的种属差异。同时，每一泳道的相似度较高，表面填料系统优势菌群具有一定的稳定性，对驯养后接种污泥进行挂膜，有利于序批式沸石填料工艺长期稳定运行。

图5 PCR-DGGE 凝胶电泳各条带相似性热力图

采用非加权组平均（UPGMA）法对相似性矩阵中的数据进行了聚类处理分析，聚类结果如图6 所示。所有样品共被划分为2 个类别，其中1，3，4 号，2，5，6 号样品分别被划分为一类。该聚类结果（图6）与相关性情况（图5）及现实状况（图4）较为相符。

图6 DGGE 图谱聚类分析图

3.3 多孔沸石载体生物膜微生物群落分析

不同填料层生物膜数据分析见表3，从1 号到6号样品种群丰富度为26，24，23，17，19，20；其中1号样品种群丰富度最高。

表3 不同填料层生物膜数据分析

样品细菌属的水平百分比如图7 所示。所有样本中都存在着大量的噬氢菌，为样品的优势菌种；5号采样点的丰度最高（63.28%），平均丰度为44.78%。研究表明，噬氢菌［14］可对很多有机污染物特别是芳烃类污染物起到很好的降解作用。乳球菌属为化能异养及革兰氏阳性兼性厌氧，通过某些碳水化合物进行发酵产酸［主要为L（+）-乳酸］，同时这一过程无气体产生。陶厄氏菌属为反硝化细菌属［15］，在脱氮过程中可分解如甲醛和乙醇等溶解性有机物，而硝化螺旋菌能够将亚硝酸盐转化成硝酸盐。

图7 细菌属水平百分比

4 结论

（1）水力停留时间为3.0 h 时，多孔沸石混合填料容积负荷增大，氨氮去除率可稳定在84.3%～91.8%，氮损失及氮回收率分别为341.21 mg 及87.42%，氮素综合去除性能最佳。

（2）对于填料层内外的微生物群落，其结构存在明显差异，外层的微生物群落丰富度更高，而系统上、下层群落多样性则高于中层，不同条带聚类结果及相似度与现实状况相符。

（3）在检测条带中观察到能够降解各类有机污染物的菌属（如噬氢菌）和硝化菌、反硝化菌，表明该填料具有优异的氮素去除性能。