恩格列净通过c-Jun氨基末端激酶信号通路改善2型糖尿病性骨质疏松症的机制研究

胡燕琳 魏琦

2型糖尿病性骨质疏松症(T2DOP)是一种以骨折风险增加的代谢性疾病,其中糖尿病导致骨脆性增加、骨量减少等是导致其发生的主要因素[1]。目前我国T2DOP的患病率为37.8%,且糖尿病发病率的增加导致T2DOP发病率呈上升趋势[2-3],钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂(SGLT2i)是一种不需要β细胞参与的口服降糖药物,其不仅具有降血糖作用,还能对疾病代谢异常发挥改善作用[4]。恩格列净是SGLT2i之一,具有高选择性,能通过抑制肾脏近曲小管S1、S2段的SGLT2阻止肾脏对葡萄糖的重吸收,通过引导额外的葡萄糖排泄到尿液中而达到降低血糖的目的[5-6]。根据临床研究结果显示,恩格列净还可降低肾病发生发展[7-8],目前其对骨代谢的影响存在争议。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族成员之一,可通过磷酸化没有活性蛋白中的丝氨酸和苏氨酸残基调控细胞生长、凋亡等多种过程[9]。相关研究发现,JNK信号通路中的调节酶类可介导多种疾病的发生发展,如肥胖、胰岛素抵抗及2型糖尿病(T2DM)等[10],但其在T2DOP中的作用尚不清楚。因此,本研究旨在探讨恩格列净能否通过JNK通路改善T2DOP。

材料与方法

1.材料:SPF级、12周龄、体重280 g～300 g的雌性SD大鼠45只,均购自济南朋悦实验动物繁育有限公司[许可证号:SCXK(鲁)2019-0003]。所有大鼠统一饲养在我院的动物房内,环境保持在温度18～22 ℃和相对湿度40%～70%,室内昼夜节律光照(12 h/12 h),自由饮水摄食,适应1周。恩格列净片(国药准字H20213065,正大天晴药业公司);兔抗JNK1、兔抗p-JNK1、兔抗c-Jun、兔抗p-c-Jun、兔抗β-actin、山羊抗兔IgG(美国Abcam公司);链脲佐霉素(STZ,纯度>99%,合肥博美生物科技有限责任公司);蛋白提取试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);HE染色试剂盒(北京博奥拓达科技有限公司);JNK激活剂Anisomycin(美国Abcam公司);血糖仪(型号:ACCU-CHEK,上北京中西远大科技有限公司);光学显微镜(型号:DM500,上海光学仪器五厂);凝胶成像系统(型号:Gel Doc XR+,美国伯乐公司)。

2.方法

(1)分组和模型制备[11]:将45只大鼠随机分为假手术组(sham组)10只和造模组35只。造模组所有大鼠均制备T2DOP模型,予高糖高脂饮食(正常饲料66.5%、猪油30%、胆固醇2.5%、脱氧胆酸1%)喂养8周,腹腔注射STZ溶液30 mg/kg建立T2DM模型,当尾静脉采血空腹血糖≥16.7 mmol/L时,可视为造模成功。35只大鼠中有3只大鼠造模失败并予剔除。T2DM大鼠模型造模成功后2周,采用双侧卵巢摘除法制备骨质疏松(OP)大鼠模型,当Micro-CT测定结果示骨密度下降、骨组织形态异常、骨质破坏等时,可视为模型制备成功。32只大鼠中共有30只成功建模,按照随机数字表法将其分为T2DOP组、EM组(予恩格列净干预)、EM+Anisomycin组(予EM+JNK激活剂Anisomycin干预),每组各10只。sham组大鼠予普通饲料饲养8周,然后予等量(30 mg/kg)生理盐水腹腔注射2周后行开腹手术(未摘除双侧卵巢)。将恩格列净片用0.5%CMC-Na溶液配制成2 g/L的溶液,EM组大鼠予恩格列净溶液10 mg/kg、每日1次灌胃,连续4周;EM+Anisomycin组大鼠在EM组处理方法基础上,经腹腔一次性注射JNK激活剂Anisomycin 5 mg/kg;同时sham组和EM组予等量生理盐水(5 mg/kg)每日1次灌胃,连续4周。

(2)标本采集及处理:药物干预结束后12 h,称取各组大鼠体重,予巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉,取5 ml腹主动脉血于-20 ℃冰箱保存。取血后麻醉过量处死大鼠,解剖左右股骨,分别进行骨生物力学分析和显微CT分析,后一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定,另一部分股骨保存于-80 ℃冰箱中。

(3)血糖、血脂和骨代谢检测:采集各组大鼠尾静脉全血检测尾静脉血中空腹血糖(FPG)。提取保存于-20 ℃冰箱中腹主动脉血,在4 ℃下,3 000 r/min速度离心15 min,收集血清,采用ELISA试剂盒检测血清脂质[总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)]和骨代谢指标[骨特异性转录因子(CBF-α1)、Ⅰ型前胶原氨基端原肽(PⅠNP)、骨钙素(OC)、Ⅰ型胶原交联羧基端肽(CTXⅠ)]水平。

(4)股骨生物力学分析:取各组大鼠股骨组织并固定于70%乙醇中,将股骨表面上的液体用医用纱布吸干,后将大鼠股骨放置到OST-15型分析仪上,设置加载速度为2 mm/min,跨距为20 mm。通过三点弯曲测试分析股骨的生物力学特征。根据载荷-位移曲线绘制每个生物力学特征,计算最大载荷、断裂挠度和弹性模量。

(5)Micro-CT测定股骨显微结构:取各组大鼠股骨组织,将其迅速放入新鲜配制的40 g/L的多聚甲醛溶液中进行固定。在4 ℃的环境中,固定样本24 h后,取出一部分组织,使用Micro-CT机扫描胫骨干骺端,以观察骨组织结构。用三维重建分析大鼠骨微结构,参数包括骨矿物质密度(BMD)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨体积分数(BV/TV)和骨小梁数量(Tb.N)。

(6)HE染色检测股骨组织病理学变化:取出股骨组织用PBS清洗,随后将样本置于10%EDTA溶液中,在4℃环境下进行脱钙处理20 d。后经乙醇常规脱水、二甲苯透明和石蜡包埋处理,切片机连续纵向切成厚度为5μm的组织切片,将苏木素和伊红分别加入到组织切片中,染色后置于光学显微镜下,观察大鼠骨组织结构变化。

(7)蛋白质印迹法(Western blot)检测骨组织中JNK1、p-JNK1、c-Jun、p-c-Jun蛋白表达:取大鼠股骨组织,提取组织中总蛋白;用BCA法检测总蛋白水平。将蛋白溶液的终浓度配制为2 μg/ml,将蛋白溶液置于热水中煮沸10 min,后保存在-20 ℃冰箱中。将30 μg的蛋白样品用200 V电压电泳,转移蛋白样品与PVDF膜上,用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1 h,将一抗(1∶500)加入到PVDF膜上,4 ℃孵育过夜;将PVDF膜冲洗干净后加入二抗(1∶1 000),室温孵育2 h。ECL放光液加入到细胞中,曝光显影后用Image Lab软件分析条带灰度值。

结 果

1.4组大鼠体重、FPG及血脂水平比较:4组大鼠体重、FPG及TG、TC、LDL-C水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)。T2DOP组大鼠体重明显低于sham组,FPG、TG、TC及LDL-C水平均明显高于sham组;EM组大鼠体重明显高于T2DOP组,FPG、TG、TC及LDL-C水平均明显低于T2DOP组,TG、TC及LDL-C水平均明显高于sham组;EM+Anisomycin组大鼠体重明显低于EM组,而FPG、TG、TC及LDL-C水平均明显高于EM组(P<0.05)。见表1。

表1 4组大鼠体重、FPG及血脂水平比较

2.4组大鼠骨代谢指标、骨生物力学特征及骨微结构比较:4组大鼠骨代谢指标、骨生物力学特征及骨微结构比较差异均有统计学意义(P<0.05)。T2DOP组大鼠血清CBF-α1、PⅠNP、OC及CTX-1水平、股骨最大负荷、断裂挠度、弹性模量、BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均明显低于sham组,Tb.Sp高于sham组;EM组大鼠血清CBF-α1、PⅠNP、OC及CTX-1水平、股骨最大负荷、断裂挠度、弹性模量、BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均明显高于T2DOP组,Tb.Sp低于T2DOP组;EM组大鼠血清CBF-α1、PⅠNP及OC水平、股骨最大负荷、断裂挠度、弹性模量、BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均明显低于sham组,CTX-1水平及Tb.Sp均高于sham组;EM+Anisomycin组大鼠血清CBF-α1、PⅠNP、OC及CTX-1水平、股骨最大负荷、断裂挠度、弹性模量、BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均明显低于EM组,Tb.Sp高于EM组(P<0.05)。见表2、图1。

图1 4组大鼠股骨Micro-CT三维重建图(A:sham组,骨组织结构正常;B:T2DOP组,骨密度降低、骨小梁间隙增大;C:EM组,骨密度增加、骨小梁间隙减小;D:EM+Anisomycin组,骨密度降低,骨小梁间隙增大)

表2 4组大鼠骨代谢指标、骨生物力学特征及骨微结构比较

3.4组大鼠股骨组织病理学变化及股骨组织中蛋白表达水平比较:sham组大鼠骨小梁结构清晰、形态完整,且骨小梁排列整齐呈网状;T2DOP组大鼠骨小梁数量较sham组明显减少,且大量骨小梁断裂,各空隙明显变大;EM组大鼠骨小梁数量较T2DOP组明显增加,仅有少量骨小梁断裂,可见新生骨小梁生成,且骨小梁数量明显增加、形态相对完整;EM+Anisomycin组与T2DOP组大鼠骨小梁数量及形态变化相似。见图2。4组大鼠股骨组织中JNK1、p-JNK1、c-Jun、p-c-Jun蛋白表达水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)。T2DOP组大鼠股骨组织中JNK1、p-JNK1、c-Jun、p-c-Jun蛋白表达水平均明显高于sham组;EM组大鼠股骨组织中JNK1、p-JNK1、c-Jun、p-c-Jun蛋白表达水平均明显低于T2DOP组;EM+Anisomycin组大鼠股骨组织中JNK1、p-JNK1、c-Jun、p-c-Jun蛋白表达水平均明显高于EM组(P<0.05)。见表3。

图2 4组大鼠股骨组织病理学检测结果(A:sham组;B:T2DOP组;C:EM组;D:EM+Anisomycin组;HE染色,×200)

表3 4组大鼠股骨组织中JNK1、p-JNK1、c-Jun、p-c-Jun蛋白表达水平比较

讨 论

糖尿病是一种以高血糖为特征的常见病,在世界范围内发病率较高[12-13]。T2DOP是糖尿病最严重的一种并发症,常表现为患处疼痛、功能障碍、畸形甚至骨折等症状,对患者的生活质量造成严重的影响[14]。

有学者研究发现,糖尿病患者的骨折发生率比非糖尿病患者高约50%[15]。因此,建立稳定、简便、高效的T2DOP动物模型,是寻找治疗T2DOP有效药物的重要保障。目前T2DOP建模的方法有3种,即为诱导型、自发型和转基因/基因敲除型,其中STZ诱导型因其相对便宜、高效、简便而被广泛应用。本研究采用STZ诱导并摘除卵巢,通过高血糖和雌激素缺乏共同制备T2DOP,结果显示T2DOP组大鼠体重明显降低,FPG及血脂TG、TC和LDL-C水平明显升高,BDM明显减少,骨显微结构显著受损,呈现骨质疏松症状,提示T2DOP模型制备成功。

SGLT2是肾小管上皮细胞表面的载体蛋白,其功能异常可通过导致肾小管对葡萄糖的重吸收不足引发高血糖[16]。SGLT2i可减少肾小管重吸收的葡萄糖量,增加葡萄糖在尿液中的排泄量,并促进大量的葡萄糖从尿液排出,从而有效降低血糖水平[17]。近年来研究发现,SGLT2i可减少肾小管重吸收的磷酸盐,尿液中磷酸盐的排泄量,从而对磷酸盐代谢异常导致的骨质疏松发挥治疗作用[18]。恩格列净是临床常用的SGLT2i之一,具有高选择性、高亲和力,且能够有效抑制SGLT2载体。本研究结果显示,EM组大鼠FPG及血脂TG、TC和LDL-C水平明显降低,提示恩格列净可有效改善T2DOP临床症状,对T2DOP发挥治疗作用。CBF-α1、PⅠNP、OC和CTX-1是与骨代谢密切相关的重要指标,王少容等[19]的研究证实,可通过检测血清中PⅠNP、OC、β-CTx等指标预测骨质疏松程度。本研究结果显示,EM组大鼠血清中CBF-α1、PⅠNP、OC、CTX-1水平及BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、股骨最大负荷、断裂挠度和弹性模量均明显增加,Tb.Sp降低,提示恩格列净可对T2DOP大鼠骨代谢失衡和骨微结构发挥改善作用。

JNK是MAPK家族成员之一,有研究发现糖尿病患者中JNK信号通路被激活,其活化能够抑制胰岛素分泌,同时增强胰岛素抵抗,导致机体水平持续高表达[20]。c-Jun是一个重要的转录因子,也是JNK下游分子之一。研究发现糖尿病患者中c-Jun表达水平升高,可介导胰岛素信号通路、脂肪代谢等[21]。近年来研究发现,JNK/c-Jun信号通路在T2DOP中发挥重要作用[22],抑制该信号通路可能是治疗T2DOP的新策略。本研究结果显示,T2DOP组大鼠股骨组织中JNK1、p-JNK1、c-Jun、p-c-Jun蛋白表达水平明显升高,EM组大鼠股骨组织中JNK1、p-JNK1、c-Jun、p-c-Jun蛋白表达水平明显降低,以上结果均提示恩格列净可抑制T2DOP大鼠JNK/c-Jun信号通路激活。因此猜测,恩格列净改善T2DOP大鼠骨代谢失衡和骨微结构与抑制JNK/c-Jun信号通路激活有关。为了验证这一猜想,本研究采用恩格列净联合JNK激活剂Anisomycin共同干预T2DOP大鼠,结果显示EM+Anisomycin组大鼠体重降低、FPG升高,血清中CBF-α1、PⅠNP、OC含量、BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th及股骨最大负荷、断裂挠度和弹性模量均降低,Tb.Sp升高,提示Anisomycin可减弱恩格列净对T2DOP大鼠骨代谢失衡和骨微结构的改善作用。

综上,恩格列净可改善T2DOP大鼠骨代谢量失衡和骨微结构,对T2DOP大鼠发挥治疗作用,其作用机制可能和抑制JNK/c-Jun信号通路激活有关。由于时间和成本等因素,本研究未能单独设置高糖组以及骨质疏松组,对JNK信号通路变化的研究存在一定的局限性,有待在今后的研究中增加相应分组进一步完善。