色谱结合光谱技术建立枣仁宁神胶囊质量控制方法※

郭丁妮，席啸虎

（山西省中医药研究院，山西太原 030012）

枣仁宁神胶囊由炒酸枣仁、珍珠母、百合、郁金、茯苓、首乌藤、太子参、苦参、丹参、乌梅、合欢皮、全蝎、甘草等组成，具有养心安神、健脾养血的功效，可用于治疗心烦、心悸、失眠多梦、健忘、焦虑等症。枣仁宁神胶囊为本院院内制剂，目前医院制剂质量控制手段主要为处方中1／3以上药味完成薄层色谱法（TLC）定性检测及1味以上关键药味指标成分完成含量测定［1］。文献报道，可采用TLC进行中药制剂定性检测和高效液相色谱（HPLC）进行定量检测［2-4］。在实际操作过程中，此标准还有一些待改进之处：医院制剂基本为水提，大多药材水提后指标成分转移率较低，检测效果不佳；TLC及HPLC不能有效验证动物类药材，同时不能对制剂的综合成分进行分析；TLC和HPLC技术需要的人力、财力和时间较多。医院制剂质量控制需对制剂中不同功效药材的综合成分进行综合把控，对主要药材及其主要成分进行重点把控，并合理、有效、及时地反馈质量信息［5］。近红外光谱技术（NIRS）是一种间接分析技术，具有分析速度快、多成分分析、分析成本低等优点，可用于中药定性鉴别、有效成分定量分析等方面的研究［6-8］。本研究采用色谱结合NIRS，通过建立指纹图谱和近红外快速检测模型，对枣仁宁神胶囊的综合成分和主要药材进行质量控制分析，以探索适合医院制剂质量控制的评价体系。

1 仪器与药材

1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪（Agilent公司）；Alltech 3300蒸发光散射检测器（Grace公司）；C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）（Agilent公司）；AntarisⅡ傅立叶近红外光谱仪（美国Thermo Fisher公司）；BP211D、BP310P电子天平（德国Sartorius公司）。

1.2 试药 枣仁宁神胶囊为山西省中医药研究院院内制剂，收集2019年3月至2021年8月共18个批次用于本研究。枣仁宁神胶囊的组成药物炒酸枣仁、珍珠母、百合、郁金、茯苓、首乌藤、太子参、苦参、丹参、乌梅、合欢皮、全蝎、甘草经山西省中医药研究院药剂科主任药师鉴定，符合《中华人民共和国药典》标准。

1.3 试剂 对照品丹参素钠（批号：110855-201915，质量分数纯度＞98%）、甘草苷（批号：111610-202209，纯度质量分数＞98%）、大黄素（批号：110756-201913，纯度质量分数＞98%）购自中国药品生物制品检定所。芹糖甘草苷（批号：190907，质量分数纯度＞98%）、甘草素（批号：191018，纯度质量分数＞98%）购自上海融禾医药科技发展有限公司。其余试剂为分析纯或色谱纯。

2 方法与结果

2.1 指纹图谱及指标成分含量测定

（1）色谱条件 色谱柱为C18（250 mm×4.6 mm，5μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～10 min，5%A；10～60 min，5%～40%A；60～70 min，40%～5%A），流速为1 m L·min－1；柱温为30℃，波长为230 nm，进样量为10μL。

（2）溶液的制备及色谱图 ①对照品溶液的制备：精密称定丹参素钠、芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素、大黄素等对照品适量，加甲醇配制成一定质量浓度的对照品溶液，浓度依次为：200.2、66.2、54.6、61.2、109.8μg／m L。②供试品溶液的制备：称取枣仁宁神胶囊粉末2.5 g，精密称定，置100 m L具塞锥形瓶中，加85%甲醇100 m L，称定重量，80℃水浴中加热回流30 min，超声处理20 min，冷却，补足重量，取续滤液，即得。枣仁宁神胶囊对照品及供试品色谱图见图1、图2。

图1 枣仁宁神胶囊对照品色谱图

图2 枣仁宁神胶囊供试品色谱图

（3）方法学考察 取20210614批次枣仁宁神胶囊若干份，每份约2.5 g，精密称定，运用HPLC同时检测枣仁宁神胶囊中5种化学成分的含量，进行系统的方法学考察。结果显示，丹参素钠、芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素、大黄素精密度相对标准偏差（RSD）依次为1.77%、1.97%、2.01%、1.12%、1.25%（连续进样5次），重复性RSD 依次为2.85%、2.36%、2.66%、1.54%、2.38%（连续进样5次），稳定性（样品溶液制备后1、2、4、6、12 h）RSD 依次为1.02%、1.14%、1.33%、1.85%、0.95%（连续进样5次），说明该方法具有较高的准确性。加样回收率结果见表1。

表1 枣仁宁神胶囊加样回收率结果

（4）特征图谱的建立及5种成分含量下限确定选择2019年3月至2021年8月本院生产枣仁宁神胶囊的13个批次，按照2.1项下“色谱条件”构建特征图谱，结果见图3。通过对指纹图谱进行分析，发现13个共有峰，其中可指认色谱峰5个，依次为丹参素钠（3号峰）、芹糖甘草苷（6号峰）、甘草苷（8号峰）、甘草素（10号峰）、大黄素（12号峰），平均含量依次为0.181 8%、0.030 6%、0.022 7%、0.053 4%、0.002 6%，含量下限按平均值下浮20%，依次确定为0.145 5%、0.024 5%、0.018 1%、0.042 8%、0.002 1%，具体见表2。

表2 枣仁宁神胶囊5种指标成分含量下限确定

图3 枣仁宁神胶囊特征图谱

2.2 NIRS光谱分析

（1）图谱的采集 医院制剂室实际生产工艺优化后做实验室研究，全蝎、太子参、百合直接粉碎，其余加水浸泡2 h，提取2次，每次2 h，过滤，取滤液，浓缩至一定浓度，加全蝎、太子参、百合粉末，混匀，干燥，粉碎，过筛。根据上述实验设计，分别制备包含酸枣仁、珍珠母的全处方原方剂量提取物及依次缺失上述单味药的对照提取物，按制剂制备工艺制成粗粉，备用。共制备枣仁宁神方全方提取物粗粉20批次，缺枣仁方提取物粗粉15批次，缺珍珠母方提取物粗粉15批次。各样品置于样品杯中，等量装样，约5 g，有效覆盖样品杯底面。采集条件：分辨率8 cm－1，扫描次数32次，扫描范围4 000～10 000 cm－1，每次扫描前摇荡样品杯，每个样品重复装样并扫描3次，同时获取平均值图谱。20批全方、15批缺枣仁方、15批缺珍珠母方共50批的200条NIRS图叠加图见图4。

图4 枣仁宁神胶囊近红外光谱叠加图

（2）NIRS模型的建立及验证 在TQ analyst光谱分析软件中导入已采集好的200条光谱，按4∶1的比例分配定标集和验证集，对选中光谱进行波长选择、标准化处理和微分计算，建立相应的数学模型，并进行模型内验证。最终确定的模型数据为：Constant预处理，检测波长范围为4 000～10 000 cm－1全谱。模型验证，准确度依次为：是否缺酸枣仁100.0%，是否缺珍珠母97.5%。

3 讨论

本研究运用色谱结合光谱技术建立枣仁宁神胶囊质量控制方法，首先通过建立特征图谱，发现有13个共有峰，其中可指认的有5个成分，分别为丹参素钠、芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素、大黄素，并按照平均值的80%确定各成分的含量下限，依次为0.145 5%、0.024 5%、0.018 1%、0.042 8%、0.002 1%，结合特征图谱中未能指认的共有峰对处方中的整体成分进行有效把控。大黄素为首乌藤检测成分，首乌藤可养血安神、祛风通络；丹参素钠为丹参指标成分，丹参可行气活血、清心除烦以安神；芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素为甘草指标成分，甘草能健脾益气、调和诸药。上述药物与其他药物配伍，可养心安神、健脾养血、疏肝解郁、调畅情志。

枣仁宁神胶囊重用炒酸枣仁为君药，酸枣仁可收敛生津、滋补肝胆、宁心安神，适用于治疗虚烦难以入眠、惊悸多梦等病证，珍珠母可定肝潜阳、定惊安神，与酸枣仁配伍，可加强养心安神之效。酸枣仁皂苷A 和B均为脂溶性成分，在枣仁宁神胶囊生产过程中转移率较低，无法用HPLC有效检测；珍珠母为动物类药，其成分无法用TLC和HPLC有效检测，或检测结果没有专属性。因此本研究采用NIRS对2种药味建立快速定性检测模型，以检测制剂中是否含有这两种药材，结果显示准确率依次为100.0%和97.5%，但对其定量检测仍需进一步建立检测模型。