白术高效液相色谱指纹图谱及多指标成分含量测定研究

李春沁，凌海燕，开拓，杨安东，杨军（四川省中医药科学院，四川 成都 610041）

白术为菊科植物白术Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根茎，性温，味苦、甘，归脾、胃经，具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎之功效[1]，主要分布于我国浙江、安徽、湖北、湖南等地。研究表明，白术主要含有挥发油、多糖和内酯类等化学成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗抑郁、调节胃肠、调节免疫、调节脂质代谢、保肝等多种药理作用[2-4]。国家中医药管理局公布的第一批经典名方目录100首方剂中含白术的有13首，第二批经典名方目录（儿科部分）7首方剂中含白术的有3首，但白术的质量标准尚不完善，《中国药典》2020 年版中尚无白术含量测定和指纹图谱测定项[1]。现有文献关于白术的质量研究，多集中于白术指纹图谱研究[5-8]，或含量测定研究[9-11]，同时测定其指纹图谱和含量的研究较少[12]。白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、苍术酮是白术的主要有效成分，但白术内酯类成分含量较低，且光谱吸收不一，高效液相色谱法单一波长下同时测定多成分难度较大。相较于单一波长，多波长切换更能使色谱峰达到理想的响应值，更能准确、直观地反映多组分下色谱峰的信息[13]。本研究采用高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）多波长切换法建立的白术HPLC 指纹图谱色谱峰信息更加丰富，结合化学计量学研究，评价并筛选白术药材中的差异性成分，同时测定其中4 种差异性成分含量，以期为白术质量评价和质量标准的提升提供参考，同时为白术药效物质基础研究及其相关复方研究等奠定基础。

1 仪器与材料

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；XS205 型电子天平（德国梅特勒托利多公司）；KH7200E 型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；Heraeus Multifuge X1R 型高速冷冻离心机[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]。对照品白术内酯Ⅰ（批号：111975-201501，纯度99.9%）、白术内酯Ⅱ（批号：111976-201501，纯度99.9%）、白术内酯Ⅲ（批号：111978-201501，纯度99.9%），中国食品药品检定研究院；苍术酮（批号：MUST-22050910，纯度96.0%），成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。37批白术药材均于产地收集，经四川省中医药科学院资源所方清茂研究员鉴定为菊科植物白术Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根茎。样品来源信息见表1。

表1 白术药材来源信息Table 1 Source information of Atractylodis Macrocephalae Rhizoma （AMR）

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.05%磷酸水（B），梯度洗脱：12%～20%A（0～7 min），20%～58%A（7～19 min），58%～63%A（19～29 min），63%～68%A（29～43 min），68%～75%A（43～48 min）， 75%～95%A（48～51 min），95%～95%A（51～66 min）；流速：1 mL·min-1；检测波长：220 nm（0～32 min），276 nm（32～38.5 min），242 nm（38.5～54 min），220 nm（54～66 min）；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.2 对照品溶液的制备分别取对照品白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、苍术酮适量，精密称定，加甲醇溶解并定容至10 mL，得到浓度分别为1.384、1.500、1.825、2.008 mg·mL-1的对照品溶液。精密吸取各对照品溶液适量，加甲醇稀释，制成白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、苍术酮浓度分别为6.918、7.498、9.126、100.411 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备取白术药材样品粉末约1.00 g，精密称定，置于具塞离心管中，精密加入甲醇25 mL，称定质量；超声提取30 min，冷却，称定质量；用甲醇补足损失的质量，摇匀，过0.45 μm 微孔滤膜；取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1精密度试验 取同一批供试品溶液（S19），按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录色谱图。以苍术酮（8 号峰）为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD 小于0.07%，相对峰面积的RSD 小于1.13%，表明仪器精密度良好。

2.4.2稳定性试验 取同一批供试品溶液（S19），按“2.1”项下色谱条件，分别在0、 4、8、12、24、48 h 进样测定，记录色谱图。以苍术酮为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD 小于0.09%，相对峰面积的RSD 小于3.43%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.4.3重复性试验 取同一批白术样品（S19）6 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，记录色谱图。以苍术酮为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD 小于0.05%，相对峰面积的RSD小于3.70%，表明方法重复性良好。

2.5 指纹图谱的建立及相似度评价取37 批白术样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件依次进样测定，记录色谱图。将数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012年版），以S12 号样品图谱作为参照图谱，设定时间窗宽度为0.1 min，采用中位数法，通过多点校正和Mark 峰匹配建立叠加图谱和对照图谱（R）。见图1-A和图1-B。共标定9个共有峰，通过与对照品（图1-C）比对，指认了其中4 个色谱峰，分别为白术内酯Ⅲ（峰2）、白术内酯Ⅱ（峰4）、白术内酯Ⅰ（峰5）、苍术酮（峰8）。以对照图谱（R）作为参照图谱，进行相似度评价。相似度评价结果见表2。37批白术样品图谱与对照图谱相似度为0.539～0.996，除S16 外，其余样品与对照图谱相似度均在0.84 以上，表明所建立的指纹图谱方法可用于白术药材的整体质量控制。以峰面积较大，分离度高，且为白术有效成分的8号色谱峰苍术酮为参照峰（S），计算得到各共有峰相对保留时间的RSD＜0.2%，相对峰面积的RSD 差异较大（见表3），表明不同批次样品所含化学成分种类相似，但含量存在差异。

注：A. 37批白术药材叠加图谱；B. 对照图谱（R）；C. 混合对照品图谱。2. 白术内酯Ⅲ；4. 白术内酯Ⅱ；5. 白术内酯Ⅰ；8.苍术酮图1 白术药材高效液相色谱（HPLC）指纹图谱Figure 1 HPLC fingerprint of AMR

表2 37 批白术药材样品相似度评价结果Table 2 Similarity of 37 batches of AMR samples

表3 37 批白术药材样品共有峰相对峰面积Table 3 The relative peak areas of common chromatographic peaks of 37 batches of AMR samples

2.6 化学计量学分析

2.6.1系统聚类分析（HCA） 将各共有峰相对峰面积导入IBM SPSS Statistics 25.0 软件，采用中位数聚类法，以余弦距离作为分类依据进行系统聚类分析。结果见图2。当判别距离为5 时，37 批白术样品聚为3 类，即S1～S15、S17～S22 聚为第1 类，S23～S37聚为第2类，S16单独聚为第3类。第1类样品来源于浙江省磐安县和新昌县、湖北省蕲春县、安徽省亳州市，第2类样品来源于浙江省磐安县，说明白术药材分类存在产地交叉现象；第1 类样品与第2 类样品收集于不同的时间段，说明白术样品的分类也可能与样品的储存有关；第3 类样品S16 来自于四川省乐山市，区别于第1 类样品和第2 类样品，这可能与产地因素相关，也可能是偶然因素所致。

图2 37 批白术样品聚类分析树状图Figure 2 Hierarchical clustering analysis for 37 batches of AMR

2.6.2主成分分析（PCA） 将37 批白术样品的9 个共有峰的峰面积导入IBM SPSS Statistics 25.0 软件，对上述的37×9 阶数据矩阵进行主成分分析，筛选影响白术药材质量的差异性成分。KMO 检验统计量为0.708，Bartlett’s 球形检验统计量为0.000，表明适合进行主成分分析。主成分特征值及方差贡献率、成分矩阵、主成分因子（FAC）得分矩阵分别见表4～表6。以特征值（λ）＞1 为标准提取得到3个主成分，3个主成分累计方差贡献率为93.148%，说明前3个主成分即可代表样品93.148%的信息。由表5 可知，峰6、峰7、峰8（苍术酮）、峰9 对主成分1 贡献最大，峰2（白术内酯Ⅲ）、峰4（白术内酯Ⅱ）、峰5（白术内酯Ⅰ）对主成分2 贡献最大，峰1 对主成分3 贡献最大，故这些成分是影响白术药材质量的重要因素。

表5 37 批白术样品成分矩阵Table 5 Component matrix of 37 batches of AMP

表6 37 批白术样品主成分因子得分矩阵Table 6 Score matrix of principal component factor for 37 batches AMR

以F1、F2、F3代表3 个主成分作为37 批白术样品成分所表达的信息，结合表4、表6 数据进一步计算得到白术样品主成分得分，从而得到综合评分（F）模型。F=（45.580F1+32.000F2+15.569F3）/93.148。结果见表7。S1～S15、S17～S22 三个产地样品的平均排名为湖北＞浙江＞安徽，说明该批次白术样品质量以湖北最好，浙江居中，安徽最差，说明同期收集的不同产地的白术样品存在质量差异；S23～S37 样品（2022 年4 月收集），得分分数较高，排名集中且靠前，说明新收集的浙江磐安白术样品质量较好，这可能与样品储存状态和储存时间有关。

表7 37 批白术样品主成分得分及综合得分Table 7 Principal component score and comprehensive score of 37 batches of AMR

2.6.3偏最小二乘法判别分析（PLS-DA） 根据聚类分析结果，对37 批样品进行有监督的PLS-DA 判别分析，绘制二维散点图。见图3-A。S16 偏离程度较大，其余样品除S24 和S34 外仍可分为两类，与聚类分析结果基本一致。但组内样品离散程度较大，说明各样品之间质量存在较大差异。为进一步筛选引起白术样品之间差异的标志性成分，以VIP 值＞1 作为评价标准，筛选出2（白术内酯Ⅲ）、4（白术内酯Ⅱ）、5（白术内酯Ⅰ）、8（苍术酮）、9号色谱峰5个化学成分。见图3-B。表明上述5 个成分是影响白术样品质量差异的标志性成分。

注：A. 白术样品PLS-DA得分图；B. 变量重要性投影图图3 37 批白术样品的PLS-DA 分析Figure 3 PLS-DA for 37 batches of AMR

2.7 含量测定色谱条件及溶液制备同“2.1”“2.2”和“2.3”项下。

2.7.1线性关系考察 精密吸取“2.2”项下各对照品溶液适量，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成白术内酯Ⅰ质量浓度为1.384、 2.767、 6.918、 13.836、27.672、55.345 μg·mL-1，白术内酯Ⅱ质量浓度为1.500、2.999、7.498、14.995、29.990、59.980 μg·mL-1，白术内酯Ⅲ质量浓度为1.825、3.650、9.126、18.252、36.503、73.007 μg·mL-1，苍术酮质量浓度为20.082、40.165、100.411、200.823、401.647、803.293 μg·mL-1的系列浓度混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以对照品溶液的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果见表8。

表8 白术中4 个成分的线性关系考察结果Table 8 Results of linear relationship for four components of AMR

2.7.2精密度试验 取“2.2”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积，计算得白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、苍术酮峰面积的RSD 分别为0.30%、0.51%、0.33%、0.34%，表明仪器精密度良好。

2.7.3稳定性试验 取同一批供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、4、8、12、24、48 h 进样测定，计算得白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、苍术酮峰面积的RSD 分别为1.03%、1.01%、0.87%、0.87%，表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.7.4重复性试验 取同一批白术样品6 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件分析，计算得白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、苍术酮平均含量分别为0.181、0.226、0.259、4.745 mg·g-1，RSD 分别为1.71%、1.33%、2.20%、1.95%，表明方法重复性良好。

2.7.5加样回收率试验 取已知成分含量的白术样品粉末，精密称定，平行6份，分别加入与样品含量相当的对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定。结果白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、苍术酮的平均加样回收率分别为94.63%、97.88%、95.65%、96.48%，RSD分别为3.58%、4.44%、3.67%、2.36%。

2.7.6样品含量测定 取37批白术样品溶液，进样测定。计算样品中4个成分的含量。结果见表9。

表9 37 批白术样品中4 个成分含量测定结果（mg·g-1，n=2）Table 9 Results of contents determination for of four compounds of 37 batches of AMR（mg·g-1，n=2）

3 讨论

本研究对白术药材的整体质量进行评价，并筛选影响其质量的差异性成分。对提取溶剂（甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、50%甲醇、70%甲醇、水）、料液比（1∶10；1∶25；1∶50）、提取时间（15、30、60 min）进行了考察，最终选择料液比为1∶25，甲醇超声30 min为提取条件。比较了不同色谱柱[Phenoment Gemini C18（250 mm × 4.6 mm， 5 μm）、Agilent ZORBAX Extend - C18（250 mm × 4.6 mm， 5 μm）、 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]、不同流动相（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水）以及不同柱温（25、30、35 ℃）对色谱图的影响。当使用Agilent ZORBAX Extend-C18色谱柱，流动相为乙腈-0.05%磷酸水时，色谱峰分离效果较好，基线相对平稳。采用DAD 检测器对供试品溶液进行全波长扫描，发现白术中各成分主要在220、242、276 nm波长处吸收较强，其中白术内酯Ⅰ在276 nm 波长下吸收最强，白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ和苍术酮在220 nm波长下吸收最强，故选择了“2.1”项下的色谱条件。

相似度评价结果表明，不同白术样品化学成分种类相似，但含量存在一定差异。化学计量学分析结果表明，除样品S16、S24、S34外，34批白术药材可分为2 类，S1～S15、S17～S22 分为第1 类，其余样品聚为第2 类，第1 类和第2 类样品存在产地交叉现象，同一产地、不同产地白术药材质量均存在差异；白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、苍术酮和未知成分峰9是影响白术质量的主要因素，未知成分峰9 有待进一步研究鉴定。含量测定结果表明，第2 类白术样品中白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和苍术酮的平均含量分别是第1 类样品的1.37、2.36、1.95、2.85 倍，第2 类白术样品中白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和苍术酮的平均含量分别是第1 类样品中浙江白术样品的1.35、2.45、2.08、3.24 倍，说明白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和苍术酮均是白术质量的差异性成分。这与PCA 和PLS-DA 结果一致，亦与姚兆敏等[14]的研究结果相符。白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和苍术酮是白术的主要有效成分，具有多种药理活性[14-16]，且是影响白术质量的重要因素，建议将其列为白术质量控制的指标性成分。化学计量学和含量测定研究结果显示，影响白术药材质量的因素一方面与产地环境相关，另一方面可能与样品储存状态和储存时间有关，而储存状态和储存时间可能占主导因素。据报道[9]，白术中苍术酮不稳定，易分解转化成其他成分，白术药材粉碎8 h 后，苍术酮含量明显下降，而将粉末制成供试品溶液后，则相对稳定。本研究中S1～S22 收集后即粉碎，以粉末形式储存，苍术酮含量较低可能与此有关，而白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ的含量变化原因还有待进一步研究。

本研究建立的白术HPLC 指纹图谱和含量测定方法简便、快速，重复性好，可为白术药材及饮片的整体质量评价和白术质量标准的提升提供参考，为白术药效物质基础研究及其相关复方研究等奠定基础。