地龙蛋白对糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化及其勃起功能的影响

冀小卫，张爱平，刘黎明，杨佳树，邢喜平（.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730000）

勃起功能障碍（Erectile dysfunction，ED）是指男性无法达到或维持能够满足性交要求的阴茎勃起[1]。研究[2-4]显示，男性糖尿病患者患有ED 的可能性是非糖尿病患者的1.9～4 倍，且患病时间较非糖尿病患者大幅提前。阴茎海绵体平滑肌（Corporal cavernous smooth muscle，CCSM）舒张是阴茎勃起的必要条件之一。阴茎海绵体平滑肌细胞（Corporal cavernous smooth muscle cells，CCSMC）是CCSM 松弛的主要效应细胞和构成CCSM 的基本单位，占海绵体细胞总数的38.5%～52.0%，也是保障CCSM 舒张和收缩生理功能的基本单位[5-6]。CCSMC 表型转化包括收缩型和合成型（增殖型）两种，二者在一定条件下可以相互转化。由“收缩型”向“合成型/增殖型”的转化称为表型转化，反之称为逆表型转化。研究[7]显示，CCSMC 表型转化常常伴随出现在糖尿病性勃起功能障碍（Diabetic erectile dysfunction，DMED）大鼠及阴茎海绵体神经（Cavernosum nerve，CN）损伤性ED 大鼠等动物模型中。由此可见，CCSMC 表型转化与ED 关系密切。

地龙蛋白提取自中药地龙，具有抗氧化、抗炎、抗纤维化、抗凝、降压、改善微循环等多种药理作用。本课题组前期研究[8-9]表明，地龙蛋白能够改善DMED 大鼠的勃起功能，其机制可能与调控Nrf2/ARE 信号通路，抑制氧化应激、炎症反应，增加血清睾酮含量有关。但尚未从CCSMC 表型转化角度研究其改善DMED 大鼠勃起功能的作用及机制。因此，本研究拟建立DMED 大鼠模型，从CCSMC 表型转化方面进一步探讨地龙蛋白防治ED的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 动物经交配实验证实勃起功能正常的60 只雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，由甘肃中医药大学动物实验中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（甘）2020-0001，动物质量合格证号：62001000000617。本动物实验经甘肃中医药大学实验动物伦理委员会审批，批文号：2020-149。

1.2 药物及主要试剂地龙蛋白，宝鸡市方晟生物开发有限公司，批号：20210511；枸橼酸西地拉非片，齐鲁制药有限公司，批号：1D0291D82；链脲佐菌素（STZ），北京索莱宝科技有限公司，批号：421D022；戊巴比妥钠，中国医药集团上海化学试剂公司，批号：20030816；阿扑吗啡（APO），美国APExBO 公司， 批号： B6936113377BD； 柠檬酸（批号：20201201）、柠檬酸钠（批号：20210501），均购自烟台市双双化工有限公司；乙醇、氯仿、异丙醇，均购自天津富宇精细化工有限公司；α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体（批号：42933）、肌间线蛋白（Desmin）抗体（批号：39925）、Ⅰ型胶原蛋白（Collagen Ⅰ）抗体（批号：822102681），均购自美国Genetex 公司；平滑肌肌球蛋白重链（SMMHC）抗体（批号：B74RC）、骨桥蛋白（OPN）抗体（批号：B6701）、GAPDH 抗体（批号：B1510），均购自美国Immunoway 公司；反转录试剂盒（批号：11141-C）、PCR 试剂盒（批号：11202ES08），均购自上海翊圣生物科技有限公司。

1.3 主要仪器RS232C 型微量核酸测定仪，德国Eppendorf 公司；ABI-9700 型PCR 扩增仪，美国Applied Biosystems 公司；全自动样品快速研磨仪，上海净信科技有限公司；Quanstudio 3 型荧光定量PCR仪，美国Thermo Fisher公司；Power PacTMBasic型电泳转印系统，美国Bio-Rad 公司；超低温冰箱，中科美菱低温科技公司；BX43+SC 50 型显微拍照系统，日本奥林巴斯有限公司；Mini Chemi 610 型全自动化学发光成像系统，北京六一生物科技有限公司；Powerlab 多导生理记录仪、LabChart 数据采集分析系统，澳大利亚ADInstruments公司。

1.4 分组、模型复制及给药[8-9]大鼠适应性饲养1 周后，随机分为空白组、模型组、西地拉非组（5 mg·kg-1）及地龙蛋白低、中、高剂量组（45、90、180 mg·kg-1）。空白组给予普通饲料喂养，其他各组均采用高脂饲料连续喂养。1 周后，空白组大鼠腹腔注射柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液，其他各组大鼠均腹腔注射柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液配制的STZ 溶液（0.1 mol·L-1，pH=4.0～4.5，给药剂量50 mg·kg-1）。3 d 后，大鼠尾静脉点刺采血测定随机血糖，若随机血糖＞16.7 mmol·L-1，且出现“三多一少”（多饮、多尿、多食、体质量下降）者，则视为糖尿病大鼠模型复制成功。继续饲养8周后，大鼠颈部注射100 μg·kg-1APO溶液，置于黑暗且安静的房间中0.5 h；观察大鼠阴茎勃起状态，若龟头充血、突出包皮即视为阴茎勃起，记录大鼠阴茎勃起次数。未见阴茎勃起者视为DMED 大鼠模型复制成功。造模成功后，给药组按相应剂量灌胃给药，空白组和模型组分别给予等量生理盐水灌胃，每日1 次，连续4 周。实验中测定各组大鼠造模前、造模第3天、给药4 周后的血糖水平及体质量。

1.5 大鼠勃起功能评估用3%戊巴比妥（40 mg·kg-1）左下腹注射麻醉大鼠后，暴露颈动脉血管，并在腹部正中切一纵行切口，找到大鼠前列腺，并延伸至其后叶背侧，充分暴露大鼠阴茎海绵体神经。采用多导生理记录仪的双极电机钩住大鼠阴茎海绵体神经并固定；将充满肝素生理盐水的PE-50软管与压力传感器连接，分别插入大鼠颈总动脉近心端和阴茎海绵体中，并记录颈动脉内压（MAP）、阴茎海绵体内压（ICP）数值；通过LabChart 数据采集分析系统处理数据，计算ICP/MAP比值，以评估大鼠勃起功能。

1.6 免疫组织化学法检测阴茎海绵体中α-SMA、SMMHC、CollagenⅠ、OPN 的表达情况分离各组大鼠阴茎海绵体组织，固定、脱水、包埋切片；经二甲苯、梯度乙醇脱蜡，用柠檬酸钠缓冲溶液（pH值=6.0）在90 ℃进行抗原修复；滴加3% H2O2去除过氧化酶；5% BSA 封闭抗原；4 ℃下孵育一抗[α-SMA（1∶3 000）、SMMHC（1∶1 000）、Collagen Ⅰ（1∶1 000）、OPN（1∶1 000）]过夜；PBS 洗3 次，37 ℃下孵育二抗1 h；加入DAB 显色，蒸馏水终止反应；苏木素染色，双蒸水返蓝，梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片；在光学显微镜（×200）下观察并拍照，使用ImageJ 软件分析结果，以平均光密度值（IOD/Area）表示蛋白阳性表达水平。

1.7 RT-PCR 法检测阴茎海绵体中α - SMA、SMMHC、CollagenⅠmRNA 表达水平取各组大鼠阴茎海绵体组织，采用TRIzol 法分离提取总RNA，检测RNA 纯度和含量；严格按照试剂盒说明书步骤操作，进行逆转录反应合成cDNA，反应条件：25 ℃、5 min，55 ℃、15 min，85 ℃、5 min，4 ℃、5 min；然后进行PCR 扩增反应，反应条件：预变性95 ℃、5 min，变性95 ℃、10 s，退火55～60 ℃、20 s，延伸72 ℃、20 s，共40 个循环。分析扩增曲线，计算Ct 值，以GAPDH 作为内参基因，采用2-△△Ct法分析目的基因的相对表达量。引物均由北京博迈德生物科技有限公司设计合成，引物序列见表1。

1.8 Western Blot 法检测阴茎海绵体中α-SMA、Desmin、CollagenⅠ、OPN 蛋白表达水平取大鼠阴茎海绵体组织适量，加入RIPA 蛋白裂解液，剪碎，置于低温匀浆仪中充分匀浆、裂解；以4 ℃、12 000 r·min-1离心（离心半径=8 cm）15 min，取上清液，采用BCA 法测蛋白浓度。制备蛋白样品，经过SDS-PAGE 电泳，转移至PVDF 膜；用5%脱脂奶粉封闭1.5 h；TBST 洗膜后，加入一抗[α-SMA（1∶3 000）、Desmin（1∶2 000）、Collagen Ⅰ（1∶1 000）、OPN（1∶1 000），4 ℃下孵育过夜；TBST 洗膜后，加入二抗（1∶6 000），室温下孵育1 h；TBST 洗膜，滴加ECL 发光液，置于化学发光仪中曝光、扫描。以GAPDH 为内参，采用ImageJ 软件计算目的蛋白的相对表达水平。

1.9 统计学处理方法采用SPSS 26.0 统计软件进行数据分析，并用Graphpad Prism 9.5.0 软件作图；计量资料以均数±标准差（±s）表示；若数据资料呈正态分布且方差齐性，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD-t检验，否则采用Games Howell 检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 地龙蛋白对DMED 大鼠血糖、体质量的影响结果见图1。与空白组比较，模型组大鼠在造模第3 天和给药4周后的血糖值均显著升高（P＜0.01），给药4 周后的体质量显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，给药组大鼠的血糖值及体质量均无明显变化（P＞0.05）。结果表明，地龙蛋白对DMED 大鼠血糖及体质量无明显影响。

注：与空白组比较，**P＜0.01图1 地龙蛋白对糖尿病性勃起功能障碍大鼠血糖及体质量的影响（±s，n=6）Figure 1 Effects of Lumbricus protein on blood gluocose and body mass in diabetic erectile dysfunction rats（±s，n=6）

2.2 地龙蛋白对DMED 大鼠ICP、MAP 及ICP/MAP比值的影响结果见图2。与空白组比较，模型组大鼠的ICP 及ICP/MAP 比值显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，给药组大鼠的ICP及ICP/MAP 比值均显著升高（P＜0.01）。结果表明，地龙蛋白可以提高DMED 大鼠的ICP 及ICP/MAP 比值，能够改善DMED大鼠的勃起功能。

注：MAP为颈动脉内压；ICP为阴茎海绵体内压；1 mm Hg=0.133 kPa。与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01图2 地龙蛋白对糖尿病性勃起功能障碍大鼠ICP、MAP、ICP/MAP 比值的影响（±s，n=6）Figure 2 Effects of Lumbricus protein on ICP，MAP and ICP/MAP in diabetic erectile dysfunction rats（±s，n=6）

2.3 地龙蛋白对DMED 大鼠阴茎海绵体中α-SMA、SMMHC、CollagenⅠ、OPN 蛋白表达的影响结果见图3。与空白组比较，模型组大鼠阴茎海绵体中α-SMA、SMMHC 蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），CollagenⅠ、OPN 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，各给药组大鼠阴茎海绵体中α-SMA、SMMHC 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），CollagenⅠ、OPN 蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。结果表明，地龙蛋白可以有效抑制DMED 大鼠阴茎海绵体中Collagen Ⅰ、OPN 蛋白表达，上调α-SMA、SMMHC蛋白表达，从而抑制CCSMC由收缩型向合成型（增殖型）转化。

注：A. α-SMA；B. SMMHC；C. Collagen Ⅰ；D. OPN。免疫组化染色（×200），标尺=20 μm。与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01图3 地龙蛋白对糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体中α-SMA、SMMHC、CollagenⅠ、OPN 蛋白表达的影响（±s，n=6）Figure 3 Effects of Lumbricus protein on the protein expressions of α-SMA，SMMHC，Collagen Ⅰand OPN in the penile corpus cavernosum of diabetic erectile dysfunction rats（±s，n=6）

2.4 地龙蛋白对DMED 大鼠阴茎海绵体中α-SMA、SMMHC、CollagenⅠmRNA 表达的影响结果见图4。与空白组比较，模型组大鼠阴茎海绵体中α-SMA、SMMHC mRNA 表达水平显著降低（P＜0.01），Collagen ⅠmRNA 表达水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，各给药组大鼠阴茎海绵体中α-SMA、SMMHC mRNA 表达水平显著升高（P＜0.01），CollagenⅠmRNA表达水平显著降低（P＜0.01）。

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01图4 地龙蛋白对糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体中α-SMA、SMMHC、CollagenⅠmRNA 表达的影响（±s，n=6）Figure 4 Effects of Lumbricus protein on the mRNA expressions of α-SMA，SMMHC，Collagen Ⅰin the penile corpus cavernosum of diabetic erectile dysfunction rats（±s，n=6）

2.5 地龙蛋白对DMED 大鼠阴茎海绵体中α-SMA、Desmin、CollagenⅠ、OPN 蛋白表达的影响结果见图5。与空白组比较，模型组大鼠阴茎海绵体中α-SMA、Desmin 蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），Collagen Ⅰ、OPN 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，各给药组大鼠阴茎海绵体中α-SMA、Desmin 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），CollagenⅠ、OPN 蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。结果表明，地龙蛋白可以有效抑制DMED 大鼠阴茎海绵体中Collagen Ⅰ、OPN 蛋白表达，上调α-SMA、Desmin 蛋白表达，从而抑制CCSMC 由收缩型向合成型（增殖型）转化。

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01图5 地龙蛋白对糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体中α-SMA、Desmin、CollagenⅠ、OPN 蛋白表达的影响（±s，n=6）Figure 5 Effects of Lumbricus protein on the protein expressions of α-SMA，Desmin，Collagen Ⅰand OPN in the penile corpus cavernosum of diabetic erectile dysfunction rats（±s，n=6）

3 讨论

糖尿病已经发展成为人类最严重和最普遍的慢性病之一[10-11]，而糖尿病性勃起功能障碍（DMED）是其严重并发症之一[12]。DMED 的本质是由于长期的高糖环境导致阴茎动脉和内皮功能障碍[13]，活性氧种类增多[14]，而NO 的生成减少[15]，同时由于血管紧张素和内皮素等收缩性物质的产生，提高了Ca2+浓度并激活RohA/ROCK信号通路，导致CCSMC舒张功能受损[14]。

DMED 属中医“消渴”并发症，ED 属中医“阳痿”范畴，因此可将DMED 归属为中医“消渴并发阳痿”范畴。DMED 作为消渴久病继发的症状之一，是在阴虚血瘀，筋脉失养，气血逆乱，脏腑器官受损的基础上，进一步发展而来的。因消渴阴虚津亏，燥热偏盛，病久失控，阴损及阳，热灼津亏血瘀，导致气阴两伤，阴阳两虚，脉络瘀阻，血行失畅。阴虚血瘀并存，宗筋失养，则发为阳痿[16]。因此，阴虚血瘀与宗筋受损是DMED的主要病机。

地龙性寒凉、味咸，具有清热定惊、通络、平喘、利尿等功效。药理研究[17]显示，地龙含有蛋白质及多肽类、酶类、氨基酸及二肽类、核苷类、脂肪酸类等物质，其中蛋白质为其主要药效成分之一。本课题组前期研究[9]证明，地龙蛋白的抗凝、抗氧化作用能够抑制阴茎氧化应激，通过增加NO 含量舒张CCSMC，改善糖尿病大鼠的勃起功能。本研究结果发现，与模型组比较，地龙蛋白给药组大鼠ICP、ICP/MAP 比值均显著升高，说明地龙蛋白可以改善DMED大鼠的勃起功能，但对MAP无明显影响。

研究[18]表明，糖尿病可以引起CCSMC 发生表型转化，当其表型转化达到一定程度可能导致ED 发生。因此，从CCSMC 表型转化角度干预ED，可能为临床治疗ED 提供新的策略。α-SMA 蛋白是分化早期特异性的标志物，也是应用最多的收缩型标志蛋白，其表达下调标志着细胞表型由收缩型向合成型转化[19]。SMMHC 是粗肌的主要成分，其高度局限于平滑肌细胞，是一种理想的细胞平滑肌标记物，也是鉴定平滑肌是否处于收缩型的最佳标志之一，因此成为收缩表型高度特异性的标志[20-23]。Desmin 是一种中间丝状骨架蛋白，被认为是另一个收缩型平滑肌标记物[23]。OPN 是一种分泌酸性糖基化磷蛋白，在血管平滑肌细胞中起黏附和迁移作用，也是平滑肌细胞合成表型的标志之一[23]。CollagenⅠ是胶原蛋白的主要成员之一，主要由成纤维合成并分泌，可以促进细胞增殖，并与细胞凋亡、迁移行为密切相关[24]，被认为是合成型CCSMC的分子标志物[5]。因此，本研究选择以上5 种蛋白作为研究指标，如果CCSMC 中α-SMA、SMMHC、Desmin 表达下调和/或OPN、CollagenⅠ表达上调，则提示CCSMC 由收缩型向合成型（增殖型）转化，即表型转化，反之为逆表型转化。本研究结果显示，与模型组比较，地龙蛋白给药组大鼠阴茎海绵体组织中α-SMA、SMMHC、Desmin 蛋白表达均明显上调，CollagenⅠ、OPN 蛋白表达均明显下调，提示地龙蛋白可以有效抑制CCSMC 由收缩型向合成型（增殖型）转化。

综上所述，地龙蛋白能够改善DMED大鼠勃起功能，其机制可能与通过抑制CCSMC 由“收缩型”向“合成型（增殖型）”转化有关。本研究结果可为临床防治ED提供新的思路，也为探讨CCSMC表型转化与ED之间的关系提供一定的参考。