天峡红鮰致病性嗜水气单胞菌的分离、鉴定及药敏试验

杨宗英，李裕卫，曾柳根*，杨移斌，严保华，姚毅

（1.南昌市农业科学院，江西 南昌 330038；2.中国水产科学研究院长江水产研究所，湖北 武汉 430223）

1 材料与方法

1.1 时间与地点

2023 年3 月20 日。试验地点为中国水产科学研究院长江水产研究所实验室。

1.2 样品来源

病鱼样品取自武汉江夏区某养殖场。临床症状主要为反应迟钝，食量减少，部分病鱼漂浮池边。查看发现，其体表溃烂，出现不规则圆形、椭圆形或卵圆形红斑，边缘充血，类似于“打印病”。解剖发现，病鱼肠中无食，肝脏略肿大，色略淡，胆囊膨大充盈，胆汁丰富，呈墨绿色，见图1（a）（b）（c）（d）。攻毒试验用天峡红来自同一养殖场，体质量为（500±6）g。

图1 发病天峡红

1.3 试验方法

1.3.1 病原分离鉴定

挑选颜色、形态、大小一致的优势单菌落，进一步纯化培养。将纯化后的菌株加入25%甘油，混匀后于-20 ℃保存[4]。

（2）分离菌人工感染及细菌再分离。将分离株再次在脑心浸出液琼脂平板上划线，于28 ℃恒温培养24 h；用无菌生理盐水洗下菌苔，参照麦氏比浊法及平板计数法，调整菌悬液浓度为1.0×108cfu/mL。

1.3.2 病原菌鉴定

（1）生理生化鉴定。将分离株接种于脑心浸出液琼脂平板上，置于28 ℃恒温培养24 h，对平板上的菌落进行形态学观察，同时进行革兰染色，并利用VITEK 2 compact 全自动微生物鉴定仪与革兰阴性菌鉴定卡（GN），测定该菌及标准嗜水气单胞菌[5]。

（2）基因序列测定及系统发育分析。将分离株L1，接种于脑心浸出液培养基中，28 ℃振荡培养18 h，经12 000 r/min 离心收集菌体，用试剂盒提取DNA作为PCR 模板备用。分离株16S rDNA 序列，利用通用引物进行扩增[4]，扩增产物送武汉擎科生物公司测定序列。

将分离株L1 16S rDNA 序列，在NCBI 数据库中进行序列同源性检索，选取同源性较高的嗜水气单胞菌、部分其他种属及水产常见病原菌16S rDNA序列，用渐进的多序列比对方法，进行序列在线比对。基于序列比对结果，用MEGA 5.0 软件构建进化树[6]。

1.3.3 药敏特性

分离株药敏特性分析，采用k-B 药敏纸片扩散法进行操作[7]。取单个分离株接种于脑心浸出液培养基中，经200 r/min、恒温28 ℃震荡培养18 h，用无菌生理盐水调整分离株浓度为106cfu/mL。取200 mL 菌液，均匀涂布于水解酪蛋白琼脂培养基上，贴上不同种类的药敏纸片，各纸片的中心距离≥24 mm，纸片距离培养皿边缘的距离≥15 mm，28 ℃恒温培养24 h 后，测量抑菌直径，根据药敏纸片说明书，判定分离株对不同药物的敏感性。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离

表1 优势菌回感健康天峡红试验结果

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2.2 病原菌鉴定

2.2.1 生理生化鉴定

形态学观察可见，分离菌株L1 为革兰阴性短杆菌，菌落形态特征为：呈半透明的淡黄色，菌落圆形、边缘整齐、表面凸起且光滑湿润，菌落直径1～2 mm。

生理生化反应显示，菌株L1 的丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺、β-半乳糖苷酶、β-N—乙酰氨基葡糖苷酶、脂肪酶及酪氨酸芳胺酶等反应呈阳性；能分解利用D-葡萄糖、D-麦芽糖、D-甘露糖及D-甘露醇、蔗糖、D-海藻糖等，不能分解利用古老糖、塔格糖及D-山梨醇等，能生成H2S。该菌生化特征和嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）一致[8]，生理生化试验结果见表2。

表2 菌株L1 的生理生化试验结果①

2.2.2 基因序列测定及系统发育

基于菌株L1 与其他菌株的16SrDNA 构建的系统发育树见图2。由图2 可见，分离株L1 与嗜水气单胞菌聚为一支，因此综合判定病原菌L1 是嗜水气单胞菌。

2.3 药敏试验

药敏试验结果见表3。由表3 可见，该分离株对氟苯尼考、阿奇霉素、左氧氟沙星等11 种抗生素高度敏感；对红霉素中度敏感；对利福平、阿莫西林、新霉素等抗生素耐药。

表3 药敏试验结果①

3 结论

本试验通过剖检病鱼并显微镜观察，排除了寄生虫感染的可能。回归感染试验结果表明，引起天峡红大面积发病死亡的病原菌，是分离出的优势菌株L1。PCR 扩增优势致病菌16S rDNA 基因并测序，通过NCBI 的Blast 比对显示，与嗜水气单胞菌的相似性最高。综合分析可以确定，嗜水气单胞菌为致病菌。药敏试验结果表明，该菌对氟苯尼考、阿奇霉素、左氧氟沙星等11 种抗生素高度敏感；对利福平、阿莫西林、新霉素等抗生素耐药。