HPLC-MS/MS快速测定蜂蜜中五氯酚残留

周涛，陈志民，付丽红，吴芳芳，王华珍，朱丽婷，叶宇茜，黄梅英

(丽水蓝城农科检测技术有限公司，浙江 丽水 323000)

五氯酚(pentachlorophenol，PCP)又名五氯苯酚，是一种持久性有机污染物，曾被用作杀虫剂、抗菌剂和防腐剂等[1]，且价格便宜，曾经在水产养殖过程中被广泛使用[2]。研究表明，五氯酚不仅化学性质稳定，而且残留期长，容易蓄积在水体、土壤中，并通过食物链进入动物体内，对动物的甲状腺功能、生殖系统及神经系统等均具有破坏作用[3-5]，目前已经被包括我国在内的许多国家禁止使用。

当前，有关五氯酚残留量的检测方法主要涉及食品和农产品等报道较多，主要有高效液相法、气相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法等[6-18]。气相色谱法和气相色谱-质谱法需要衍生才能上机测定，前处理时间较长且成本较高，液相法前处理繁琐，易产生假阳性，不利于样品的检测，而液相色谱-质谱法具有前处理简单、灵敏度高、成本低等诸多优点，是测定五氯酚残留量的优选方案。为此，本文结合液相色谱串联质谱抗干扰强、灵敏度高、无需衍生等一系列优点，采用液液分配提取，内标法定量，建立了蜂蜜中五氯酚残留量的快速检测方法，该方法采用氨水作碱化剂，减小了仪器受污染的风险，同时减少了前处理步骤，降低了耗材使用成本，使实验更具操作性，并具有重复性好、定量限低等诸多优点，完全适用于蜂蜜中五氯酚的定性和定量检测，对保障食品安全和提高行业检测水平具有重大意义。

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

液相色谱串联质谱仪(美国安捷伦公司G6470)、离心机(Thermo Fisher Scientific)、电子天平(瑞典梅特勒托利多公司)、Milli超纯水机(美国密理博)。

五氯酚标准品(纯度>99.0%)及同位素内标(13C6-五氯酚内标13C6-PCP)均购自上海振翔科技有限公司，甲醇色谱纯，氨水、乙酸乙酯均为分析纯。

标准溶液的稀释与配置：将五氯酚标准溶液(100 μg·mL-1)配置成10 μg·mL-1，称取五氯酚内标粉末10.0 mg于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，-18 ℃冷冻保存。分别取适量五氯酚及其内标储备液稀释配制成0.5 mg·L-1的混合标准工作液。

1.2 仪器工作条件

色谱柱：安捷伦XDB C18(2.0 mm×50 mm，1.8 μm)；流动相：甲醇+0.1%甲酸2 mmol·L-1乙酸铵水溶液，洗脱模式见表1。

表1 色谱条件Table 1 Chromatographic conditions

电喷雾正离子扫描(ESI+)：喷雾电压3 000 V；干燥气温度320 ℃，流速10 L·min-1；碰撞气为氮气；雾化器压力40 psi；鞘气温度375 ℃，流速10 L·min-1；多反应监测(MRM)模式。

1.3 实验方法

称取5.0 g蜂蜜样品于50 mL离心管中，加入适量内标溶液，然后加入10.0 mL水，准确加入12.0 mL氨化乙酸乙酯(乙酸乙酯∶氨水=9∶1，V∶V)涡旋1.0 min，超声3.0 min，置于离心机中以6 000 r·min-1离心3.0 min。吸取上清液于10 mL刻度管中，50 ℃水浴氮气吹干，加入1.0 mL定容液(甲醇∶水=1∶1，V∶V)，混匀，过膜供液质联用谱仪上机测定。

2 结果与分析

2.1 实验结果

在本实验条件下，五氯酚在6.0 min内能得到良好分离，基本无干扰峰，且分析时间短。标准溶液色谱图(MRM)如图1所示，五氯酚内标溶液色谱图如图2所示。

图1 五氯酚标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of pentachlorophenol standard solution

图2 五氯酚内标(13C6-PCP)溶液的色谱图Fig.2 Chromatogram of pentachlorophenol internal standard (13C6-PCP) solution

2.2 仪器参数的优化

本实验采用电喷雾电离源(ESI)进行了探索，分别对五氯酚和五氯酚同位素内标(13C6-PCP)进行正负离子扫描，再结合五氯酚的酸性特点，发现五氯酚及其同位素内标(13C6-PCP)结构稳定，[M-H]离子化效率很低，无法获得特征离子。故选择五氯酚中氯元素的4个同位素为母离子对(262.7/262.7；264.7/264.7；266.7/266.7；268.7/268.7)、五氯酚同位素内标(13C6-PCP)的母离子对(270.7/270.8；272.7/272.8；274.7/274.8；276.7/276.8)进行分析，结合实际通过对蜂蜜空白样品和加标样品分析过程发现五氯酚定量离子对266.7/266.7；268.7/268.7存在较大干扰，因此，选取(262.7/262.7；264.7/264.7)作为五氯酚定量定性离子对，(272.7/272.8；274.7/274.8)作为五氯酚内标(13C6-PCP)子离子；五氯酚同位素内标及其定性定量离子对、碰撞能量以及保留时间见表2。

表2 质谱条件Table 2 Mass spectrum conditions

2.3 提取溶剂的选择

目前，食品与农产品等基质中五氯酚的提取方法主要以酸化法与碱化法两种方式为主。两种提取方法各有优劣，本实验主要采用碱化法提取，碱化法常规的做法是在有机试剂中加入一定比例的三乙胺进行提取，若前处理净化未完全，极易造成上机样品中三乙胺的残留，一旦三乙胺残留量增加，时间延长，严重影响质谱仪的灵敏度，对样品检测产生重大影响。所以本文选取氨水做碱化，在未加内标的同时比较提取溶剂中氨水含量对五氯酚提取效率的影响，通过反复试验对比，试验结果见图3。当氨水含量为10%时提取效率达到53.0%，当氨水含量提高到20%时，提取效率明显下降。最终采用氨化乙酸乙酯(乙酸乙酯∶氨水=9∶1)作为提取溶剂。

图3 氨水含量与回收率Fig.3 Ammonia content and recovery rate

2.4 标准曲线验证

按内标法配置浓度为1.0、2.0、4.0、10.0、50.0、100.0 ng·mL-1的标准溶液在设定的仪器条件下进行上机确定其线性方程，结果表明，在1.0～100.0 ng·mL-1其线性方程为y=72 475.3x-1 352.26，其相关系数r为0.998。

实验结果符合检测要求，此方法可用于五氯酚药物的定量分析。

2.5 回收率及检出限

按照前处理方法称取空白蜂蜜样品18份，进行0.5、2.0和10.0 μg·kg-13档浓度加标(每档6平行)，在基质中分别加入适量的五氯酚内标(13C6-PCP)和五氯酚标准溶液，参照实验步骤处理后测定，计算平均回收率和相对标准偏差(RSD)来考察方法的准确度和精密度，在3档浓度加标水平下，五氯酚的回收率在93.5%～101.3%，RSD在4.30%～6.82%(表3)。以加标浓度为5 μg·kg-1为基准，计算得出该方法的检出限(LOD)为0.2 μg·kg-1，定量限(LQD)为0.5 μg·kg-1。实验结果表明，本方法符合实验要求，可用于实际样品的快速定量分析。

表3 回收率及精密度(RSD，n=6)Table 3 Recovery rate and precision

3 结论

本实验建立了蜂蜜中五氯酚残留量的LC-MS/MS检测方法，结合液相色谱串联质谱仪抗干扰强、灵敏度高等特有优点对前处理过程进行简化，并减少了试剂的使用量。同时该方法具有回收率高、重复性好的诸多优点，说明该方法完全适用于蜂蜜样品的定性和定量分析，为蜂蜜中五氯酚药物残留量的测定提供有力参考。