基于衍生化3-氨基-2-恶唑烷酮的夹心酶联免疫分析

张世伟，吴会玲，周迎春，王炳志，杨星星，杜业刚，汤 璐，冯荣虎,*，郭继平,*

（1.深圳市计量质量检测研究院，广东 深圳 518000；2.深圳市易瑞生物技术股份有限公司，广东 深圳 518000）

免疫检测以抗原抗体特异性反应为原理，具有时间短、成本低、操作简单等优势，被广泛应用于食品安全、环境、临床检测中，主要有夹心法和竞争法两种模式[1-2]。夹心法通过第一个抗体对体系内的抗原进行捕捉，再通过一个标记抗体形成抗体-待测分子-抗体的夹心复合物，正向输出免疫识别信号。竞争法是目标分析物和人工抗原共同竞争结合抗体，随着目标分析物浓度升高反向输出免疫反应信号，由于竞争免疫检测反应体系为竞争关系，目标分析物需要达到足够的浓度才能抑制竞争物与抗体的结合，相较于夹心法，其灵敏度更低[3-5]。长期以来的观点认为，小分子不能被两个亲和物同时亲和，不能建立夹心免疫分析方法[6-7]。因此，夹心法一般用于检测大分子，如蛋白、多肽，而竞争法主要用于检测小分子[8-9]。

近年来，随着他克莫司（804 Da）[10]、柚苷（580 Da）[11]、伊马替尼（494 Da）[12]、四环素（460 Da）[13]等分子质量小于1 000 Da的小分子夹心酶联免疫吸附检测（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）的建立，充分证明夹心ELISA适用于小分子，且能有效提高检测灵敏度[14]。Qu Huihua等[15]建立了普纳替尼（532 Da）的夹心ELISA，与同一抗体建立的竞争法相比，灵敏度提升了25 倍。因此，能否建立夹心免疫分析方法和分子质量并无直接关系，而是与表位之间的距离有关。Quinton等[16]认为两个表位之间需要间隔5 Å即可建立夹心免疫分析方法。Bai Yuchen等[17]通过构建三聚氰胺和硝基苯胺偶联物，建立了表位间隔距离仅为2.8 Å的夹心ELISA；同时该学者认为表位距离低于8.8 Å通常会引起明显的抗体空间位阻，从而高概率地阻止夹心免疫分析。夹心ELISA虽然实现了对阿维菌素（887 Da）的检测，但是检出限（limit of detection，LOD）只有1 012.1 nmol/L，远不及竞争ELISA。表位间隔距离多远才能构建具有灵敏度优势的夹心免疫分析方法，表位间隔距离多远后不再对夹心复合物的形成效率产生影响，这个两个问题仍然需要探索。

呋喃唑酮是一种经常被滥用的硝基呋喃类抗生素，其代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ）的分子质量仅为102 Da。本研究从检测方法的应用出发，将灵敏度不低于竞争法时的表位间隔距离定义为极限距离，而间隔距离对灵敏度无显著影响时的距离为理想距离，并以AOZ衍生物为模型分子加以研究，以期为其他硝基呋喃类代谢物的高灵敏度检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

AOZ抗体参考Cheng Chuchen等[18]的方法自制，LOD为20 pg/mL（竞争ELISA法）。ELISA反应检测用试液配制见冷泉港实验室手册[19]。

3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB）、抗生物素抗体-辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、亲和素-HRP 美国Sigma公司；生物素亚砜、利地霉素 上海陶术生物科技有限公司；其他化学试剂购自北京百灵威科技有限公司。

1.2 仪器与设备

96 孔酶标板 美国康宁公司；Synergy H1酶标仪、405LS自动洗板机 美国BioTek公司；Allegra 64R高速离心机 美国贝克曼库尔特公司；Milli-Q IQ 7003超纯水机 美国Merck Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 衍生物的合成

按图1所示路线合成衍生试剂。将2.0 g 4-醛基-3-硝基苯甲酸甲酯用20 mL甲醇溶解后，加入5 mL 10%的NaOH溶液，60 ℃搅拌反应2 h，反应结束后，蒸干溶剂，加入稀盐酸调为pH 3.0，用乙酸乙酯萃取，将有机相蒸干得到4-醛基-3-硝基苯甲酸1.5 g（化合物a）。

图1 衍生试剂合成及衍生化反应路线Fig.1 Synthesis of derivatizing agent and pathway of derivatization reaction

称取1.0 g化合物a，加入10 mL SOCl2，70 ℃搅拌反应3 h后蒸干溶剂，得到黄色油状物（化合物b）。将3 mL的1,4-二氧六环缓慢滴加到20 mL含有5 g 1,6-己二醇和3 g三乙胺的1,4-二氧六环溶液中，室温搅拌过夜，蒸干溶剂后使用硅胶柱层析纯化得到浅黄色粉末（化合物c）。

称取0.6 g化合物c、0.5 g生物素亚砜、0.2 g 4-二甲氨基吡啶、0.5 g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，用10 mLN,N-二甲基甲酰胺溶解后，室温搅拌反应过夜，蒸干溶解加水，用乙酸乙酯萃取后，再蒸干有机相经过柱层析纯化得到浅黄色粉末，即衍生试剂BEN-Biotin。使用乙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、1,5-戊二醇、1,7-庚二醇、1,8-辛二醇、1,9-壬二醇替代上述的1,6-己二醇合成不同长度连接臂的衍生剂。

1.3.2 AOZ-Biotin的合成

用10 mL甲醇溶解0.5 g衍生试剂BEN-Biotin，加入0.3 g AOZ，室温搅拌过夜有大量沉淀析出，过滤出沉淀，沉淀用甲醇洗涤干燥后得到目标物，为浅黄色固体粉末。

1.3.3 生物素抗体亲和位点的测定

在酶标板中包被生物素-牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）偶联物，每个孔100 μL，37 ℃孵育过夜，弃去包被液。在37 ℃使用质量分数为2% BSA的pH 7.4磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）封闭2 h后，洗板3 次。在酶标板中加入50 μL不同浓度的生物素、生物素亚砜或利地霉素，再加入50 μL HRP标记的抗生物素抗体，37 ℃孵育1 h后洗板3 次。加入TMB显色液，37 ℃孵育15 min，加入50 μL 2 mol/L硫酸溶液终止反应。使用酶标仪在450 nm波长处进行读数。使用Origin 8.5软件的四参数拟合得到拟合曲线，从而得到半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50），并计算交叉反应率。

1.3.4 夹心ELISA

在酶标板中包被抗AOZ抗体，每个孔100 μL，37 ℃孵育过夜。弃去包被液。37 ℃使用2% BSA的pH 7.4 PBS封闭2 h后，洗板3 次。在酶标板中加入100 μL样品液或AOZ-Biotin标准溶液，37 ℃孵育30 min后洗板3 次。加入100 μL HRP标记的抗生物素抗体或亲和素，37 ℃孵育1 h后洗板3 次。加入TMB显色液，37 ℃孵育15 min，加入50 μL 2 mol/L硫酸溶液终止反应。使用酶标仪在450 nm波长处进行读数。AOZ-Biotin标准溶液溶度换算成AOZ质量浓度（1 pg/mL AOZ-Biotin相当于0.17 pg/mL AOZ），并以此对数值为横坐标，以ELISA吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.5 表位极限距离和理想距离测定

20 pg/mL的AOZ-Biotin按连接臂由短到长依次使用1.3.4节的方法进行测定。以空白＋3 倍标准偏差（n＝6）作为定性阈值。首个超过定性阈值AOZ-Biotin的表位间隔距离为极限间隔距离。当吸光度到达平台区时的间隔距离为理想间隔距离。

1.3.6 样品前处理

样品衍生化前处理参考Vass等[20]所报道的方法并略作改进。称取均质后的动物组织样品2 g，加标样品的剂量分别为30 ng/kg和100 ng/kg，加入4 mL甲醇、100 μL 1 mol/L盐酸溶液和100 μL 10 mmol/L衍生试剂。37 ℃孵育16 h，期间每隔1 h使用高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）对衍生产物的产率进行测定[21]。衍生后的样品液离心取2 mL上清液，滴加饱和碳酸氢钠溶液至不产生气泡。使用0.01 mol/L pH 7.4 PBS定容至10 mL后待测。

1.4 数据处理与分析

本研究均为6 次平行测定并取其平均值。数据图利用OriginPro 2018软件绘制。ELISA标准曲线（图5）为四参数拟合曲线。

2 结果与分析

2.1 衍生剂及衍生产物的鉴定

使用电喷雾电离-MS对衍生剂中间体（化合物C）、衍生剂（BEN-Biotin）和衍生产物（AOZ-Biotin）进行负离子模式扫描。由图2可知这3 个化合物的分子离子峰分别为294.2[M-H]-、520.8[M-H]-、603.6[M-H]-，且响应值较大，证明目标化合物合成成功。

图2 化合物C（a）、BEN-BIOTIN（b）及AOZ-BIOTIN（c）的质谱图Fig.2 Mass spectra of compound C (a),BEN-BIOTIN (b) and AOZ-BIOTIN (c)

2.2 夹心模式下表位的极限距离和理想距离

小分子无法构建夹心免疫检测方法的本质并非直接由分子质量导致，而多是因为表位间距小导致的空间位阻。如果两个表位之间的距离足够远，该小分子也能被夹心结合。AOZ是禁用兽药呋喃唑酮的代谢物，易与硝基苯甲醛发生高产率的胺醛缩合衍生反应[22-23]。因为其分子质量小，目前的免疫分析方法均基于该衍生反应检测其衍生产物[24-25]。所制备的抗体对AOZ本身无交叉反应，只能识别其硝基苯甲醛衍生物，说明AOZ-Biotin中的区域A是抗体结合的主要区域（图1）。AOZ-Biotin的另一端既能结合亲和素也能结合抗生物素抗体。生物素-亲和素主要结合区域为生物素的咪唑酮环（区域B）[26]。通过交叉反应实验，生物素抗体能等同识别生物素和利地霉素（交叉反应率94%）而无法识别生物素亚砜（交叉反应率＜1%）。利地霉素与生物素具有相同的咪唑酮环，而生物素亚砜是生物素的氧化物产物（硫醚氧化为亚砜）。因此生物素抗体的识别区域既包含咪唑酮环也包含了噻唑环，即为区域C。

Quinton等[16]构建用不同长度饱和碳链连接HVA和HIS的模型分子，并使用HVA和HIS抗体进行双亲和，结果表明，两个抗原表位只需要5 个碳原子的长度（约5 Å），即可形成夹心复合物。Bai Yuechen等[17]将此极限提高到2.8 Å。上述研究还证明两个表位之间的距离越短，需要的亲和反应时间越长，检测灵敏度越差。增加待测物小分子的反应浓度和延长孵育时间均可提升这一极限，然而过低的灵敏度以及过长的孵育时间不利于该方法的实际应用。因此本实验以捕捉抗体在竞争ELISA条件下能达到的检测下限作为反应浓度，将二抗（或亲和素）的孵育时间设定为1 h。

如图3所示，当使用1,4-丙二醇作为连接臂时，吸光度超过定性阈值。此时，两个表位之间的距离为12 Å（计算方法参考文献[27]），此为双抗夹心模式下的极限距离。当使用1,6-己二醇作为连接臂时，吸光度增加幅度趋于平缓。此时，两个表位之间的距离为16 Å，为该模式下的理想距离。当使用1,4-丙二醇作为连接臂时，吸光度超过定性阈值。此时，两个表位之间的距离为13 Å，为抗体-亲和素夹心模式下的极限距离。当使用1,6-己二醇作为连接臂时，吸光度增加幅度趋于平缓。此时，两个表位之间的距离为17 Å，为抗体-亲和素夹心模式下的理想距离。说明双抗夹心亲和与抗体-亲和素夹心亲和在空间间隔上的要求几乎相同。由于目前无法对小分子与抗体的结合域进行非常精确的判断，因此得到的数据可能有5 Å以内的误差。

图3 不同连接臂AOZ-Biotin的夹心ELISA吸光度Fig.3 Absorbance of sandwich ELISA for AOZ-biotin using different spacer arms

2.3 AOZ夹心ELISA

由于硝基呋喃代谢物的分子质量过小，目前无论是色谱检测还是免疫检测均需要衍生剂进行衍生，因此衍生剂的衍生化效率对于硝基呋喃代谢物的检测非常重要[28]。邻硝基苯甲醛是一种高效的硝基呋喃代谢物衍生剂，被广泛应用于硝基呋喃代谢物检测中[29-30]。本实验所使用的衍生剂BEN-Biotin的衍生化反应原理和邻硝基苯甲醛相同，其醛基能够很好地与硝基呋喃代谢物的氨基发生缩合反应。图4为BEN-Biotin的衍生产率，反应1 h后衍生产率仅为40%，而AOZ衍生中常用的衍生剂邻硝基苯甲醛可达到72%。但其反应12 h后衍生产率可达到89%，与邻硝基苯甲醛较为接近。

图4 AOZ-Biotin的衍生产率Fig.4 Derivatization efficiency of AOZ-biotin

如图5所示，双抗夹心和抗体-亲和素夹心模式的IC50分别为22 pg/mL和12 pg/mL（以AOZ质量浓度计），LOD分别为1.8 pg/mL和0.8 pg/mL，线性范围分别为2～200 pg/mL（R2＝0.991）和1～100 pg/mL（R2＝0.988），相较于使用相同抗体所建立的竞争ELISA，其灵敏度最高提升了25 倍。本实验还考察了所建立方法对其他呋喃类药物及其代谢物、代谢物的BEN-Biotin衍生物的交叉反应。如表1所示，该方法具有良好的特异性，与所测试结构类似物的交叉反应率均小于1%。

表1 与各结构类似物的交叉反应率Table 1 Cross-reactivity of the sandwich ELISA method with analogues

图5 AOZ的夹心ELISA标准曲线（n＝6）Fig.5 Standard curves of sandwich ELISA for AOZ (n=6)

2.4 样品检测

将更为灵敏的抗体-生物素夹心ELISA应用于实际样品检测。鱼肉和虾肉样品使用HPLC-MS/MS法确定为阴性样品。在阴性样品中添加AOZ分别至30 ng/kg和100 ng/kg。使用本研究建立的夹心ELISA对阴性样品和添加样品进行检测，5 份阴性样品未产生假阳性。样品检测结果如表2所示，回收率为73%～85%，平均相对标准偏差为9.0%。说明该方法能够用于实际样品的检测。

表2 鱼肉和虾肉样品的分析结果及回收率（n＝6）Table 2 Recoveries and RSDs for spiked fish and shrimp samples (n=6)

3 结论

本研究通过连接臂将邻硝基苯甲醛和生物素偶联，形成新的衍生试剂，构建了针对小分子化合物AOZ的两种夹心免疫分析模式——双抗夹心和抗体-亲和素夹心模式。推算出在这两种模式下表位之间的极限距离和理想距离，对现有的小分子夹心复合物形成规律进行了补充。基于抗AOZ抗体和亲和素建立了AOZ夹心免疫分析方法。该方法衍生时间和衍生效率与现有的AOZ ELISA方法相同，在表位间隔17 Å时，夹心ELISA比竞争ELISA法灵敏度提升了25 倍。

该方法通过在小分子上人工嫁接第二表位并通过不通长度的连接臂连接，从而使小分子能同时被两个物质亲和（图6）。本研究不仅从理论上总结抗原表位距离与夹心复合物之间的形成规律，而且所建立的AOZ夹心ELISA方法能应用于实际样品检测，具有灵敏度高、操作简单的优点。所使用的衍生剂对硝基呋喃代谢物通用，能为其他硝基呋喃类代谢物的高灵敏度检测提供参考。

图6 基于衍生化反应的小分子夹心免疫分析方法示意图Fig.6 Schematic diagram of sandwich ELISA detection of small molecules following derivatization reaction