食品中季铵盐类消毒剂检测方法建立及北京市市售食品及膳食样品中含量分析

谢 昀，周伟娥，许秀丽，张 晶，张 峰,*

（1.中国检验检疫科学研究院食品安全研究所，北京 100176；2.国家市场监管重点实验室（食品质量与安全），北京 100176；3.北京市疾病预防控制中心，北京 100013）

季铵盐是一类阳离子表面活性剂，可通过破坏菌体外膜使内容物外渗引起微生物死亡，作为消毒剂使用历史悠久[1]。季铵盐性质稳定、使用方便，因此被广泛应用于食品加工[2]、医疗[3]、公共卫生[4]等领域。近年来，为限制新型冠状病毒的传播，季铵盐类消毒剂使用量进一步增大[5]。2020年，美国环境保护署列出的430 种可以杀灭新型冠状病毒的消毒剂产品中，有216 种含有季铵盐活性成分。同年，我国卫健委印发的《公共场所新型冠状病毒感染的肺炎卫生防护指南》中把季铵盐类列为日常卫生防疫消毒可用的消毒剂。此外，疫情期间食品外包装表面新冠病毒核酸阳性屡见报导[6]，而我国原卫生部印发的《食品用消毒剂原料（成份）名单（2009版）》规定部分季铵盐类可用于消毒食品接触容器和工具，这使得季铵盐类消毒剂在食品及相关产品链中广泛应用。

随着研究的逐步深入，人们发现季铵盐类化合物可以引起哮喘、皮肤过敏性反应和视力减退等病症[7]。食品生产、加工、贮存、销售等过程中的多次消毒会导致季铵盐类消毒剂在包材或容器等表面残留[8]，继而通过接触迁移污染食品，带来潜在食品安全风险。2013年，欧洲食品安全局对17 个成员国5 472 份食品样本中的苯扎氯铵（benzalkonium chloride，BAC）和二癸基二甲基氯化铵（didecyl dimethyl ammonium chloride，DDAC）进行了调查，发现304 份样品中的残留超过欧盟最高残留限量（maximum residue limit，MRL）[9]。2015年，德国一检测机构在我国境内的婴儿奶粉中检出季铵盐[10]。欧洲食品安全局对于食品中季铵盐类消毒剂设置的MRL不断严格。2012年，(EC)No 396/2005法规规定，BAC和DDAC的MRL为0.5 mg/kg。2014年，(EC)No 1119/2014法规将MRL降低至0.1 mg/kg。预计未来欧盟和美国将进一步加强食品中季铵盐检测[11-12]。而我国尚未对食品中季铵盐进行限量规定或开展正式的风险监测。因此，为解决我国食品中季铵盐类消毒剂污染水平不清、风险不明的问题，研究建立准确、灵敏的检测方法并开展污染水平调查具有极其重要的意义。

目前，季铵盐类消毒剂检测方法主要有离子色谱法[13]、气相色谱-质谱联用法[14]、高效液相色谱法[15]与高效液相色谱-串联质谱法[2]，研究对象主要为环境水样[16]、土壤[17]和沉积物[18]等。在食品检测领域，最多报道过7 种化合物的同时检测[19]，二辛基二甲基氯化铵（dioctyldimethylammonium chloride，DODMAC）和辛基癸基二甲基氯化铵（decyldimethyloctylammonium chloride，DDMOAC）等国内常用消毒剂检测方法鲜见报道。同时，存在方法适用基质单一的问题，例如只适用于奶粉[20-21]、冰淇淋[22]或冷冻肉[19]等。本研究在已有方法的基础上，扩大基质适用范围，覆盖高脂、高有机酸、高色素等样品，目标物种类覆盖单长链、双长链和多长链季铵盐。并根据目标物性质和结构优化色谱与质谱条件，结合不同食品基质特性改进提取与净化方法，采用基质匹配外标法定量，建立了改良QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）法前处理样品，超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS/MS）同时定量测定蔬菜、水果、水产中9 种季铵盐的分析方法。与现有方法相比，本方法简便快捷、灵敏度高、选择性强、基质效应（matrix effect，ME）弱，适用基质和目标物种类覆盖更全面，适用于批量食品中季铵盐类化合物测定，为开展我国食品季铵盐残留风险监测提供技术支持。通过对北京市市售食品及膳食样品中季铵盐含量的检测，旨在为制定我国食品中季铵盐化合物残留限量标准提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试剂

乙腈、甲醇（均为色谱纯）美国Thermo Fisher Scientific公司；甲酸（质谱纯）北京百灵威科技有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（primary-secondary amine，PSA）（40 μm）安捷伦科技（中国）有限公司；无水硫酸镁（分析纯）国药集团化学试剂北京有限公司；石墨化碳黑吸附剂（graphitized carbon black，GCB）（120～400 目）天津博纳艾杰尔科技有限公司；实验室用水由Millipore纯水仪制备。

DODMAC、DDMOAC、十六烷基二甲基苄基氯化铵（C16-BAC）、十四烷基二甲基苄基氯化铵（C14-BAC）、十二烷基二甲基苄基氯化铵（C12-BAC）、十二烷基-二甲基-2-苯氧基-乙基溴化铵（domiphen bromide，DB）、DDAC（均为标准品）德国Dr.Ehrenstorfer公司；四丁基硫酸氢铵（tetrabutylammonium hydrogen sulfate，TAHS）、十二烷基三甲基溴化铵（dodecyltrimethylammonium bromide，DTAB）（均为标准品，纯度≥99.0%）天津阿尔塔科技有限公司。

1.1.2 样品来源

北京市市售样本来源为市场随机采样，共计69 例样品，其中蔬菜30 例、水果27 例、水产12 例。采样种类具有代表性，蔬菜覆盖叶菜类、果菜类、花菜类、根菜类、茎菜类，水果覆盖柑橘类、仁果类、核果类、浆果类，水产覆盖淡水鱼、海鱼、虾。采集场所包括超市、农贸市场及流动摊等。

北京市膳食样本来源为第6次全国总膳食研究北京市样品，包括蔬菜13 例、水果8 例、水产4 例，共计25 例。通过对北京居民的膳食习惯调查及消费量数据进行聚类，依据聚类结果进行采样，并将采集得到的同一食物样品按相同比例混合，依据北京市饮食习惯加工烹调后，制得混合的膳食样品[23]。

1.2 仪器与设备

一次性注射器（1 mL）美国Welch公司；0.22 μm尼龙滤膜（有机系）安捷伦科技（中国）有限公司；聚丙烯离心管（2 mL和50 mL）美国康宁公司；Milli-R04纯水仪 德国Millipore公司；ML104/02分析天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司；HSC-12B针式氮吹仪 天津恒奥科技有限公司；旋涡混合仪德国IKA 公司；Xevo TQ-XS 三重四极杆液相色谱-质谱联用仪、ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）美国Waters公司；Eclipse XDB-C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

将食品样本匀浆，称取2.0 g（准确至0.01 g）置于50 mL聚丙烯离心管中，加入20 mL乙腈涡旋振荡，再加入2 g无水MgSO4涡旋混合1 min，超声提取15 min，4 ℃、10 000 r/min离心5 min。取上清液于另一50 mL聚丙烯离心管中，加入400 mg PSA和5 mg GCB，涡旋混匀1 min，4 ℃、10 000 r/min离心5 min。准确移取10 mL上清液置于玻璃氮吹管中，于30 ℃水浴中氮吹干，加入0.5 mL甲醇，涡旋复溶，过0.22 μm尼龙滤膜，上机待测。

1.3.2 标准溶液配制

分别准确称取9 种季铵盐标准品各10.0 mg（精确至0.1 mg），置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成1 g/L的标准储备液。-20 ℃避光保存，备用。准确吸取9 种标准储备液0.1 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成10 μg/mL混合标准储备液。按照1.3.1节方法获得空白基质溶液，将混合标准储备液用空白基质溶液逐级稀释成质量浓度为200、100、50、20、10、5、2 μg/L的系列基质匹配标准工作液，临用现配。

1.3.3 液相色谱-质谱分析

液相色谱条件：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm），流动相A为甲醇，B为0.1%甲酸＋2 mmol/L乙酸铵溶液，流动相梯度条件见表1。流速0.25 mL/min，柱温30 ℃，进样体积2 μL。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

质谱条件：电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI），正离子扫描模式，多反应监测；脱溶剂气温度：450 ℃；脱溶剂气流速：900 L/h（＋）；锥孔气流量：150 L/h；毛细管电压：3 000 V；驻留时间：20 ms。9 种季铵盐质谱检测参数见表2。

表2 9 种季铵盐化合物监测离子对参考质谱条件及保留时间Table 2 Mass spectrometric parameters and retention times of nine QACs

1.3.4 ME计算

按照式（1）计算ME：

式中：A为纯溶剂标准曲线斜率；B为空白基质匹配标准曲线斜率。

1.3.5 每日摄入量（estimated daily intake，EDI）估算

按照式（2）计算EDI：

式中：c为某种化合物在被检样品中的平均含量/（μg/kg）；F为居民日均消费量/kg；mb为人群平均体质量/kg。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

2.1.1 色谱柱的选择

考察了Eclipse XDB-C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）3 种色谱柱对9 种季铵盐分离效果的影响。发现9 种目标物在Eclipse XDB-C18柱和ACQUITY UPLC HSS T3柱上峰形不佳，出现较严重的拖尾，而在ACQUITY UPLC BEH C18柱上各物质峰形、响应、分离度良好（图1）。因此，选择ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱用于9 种季铵盐分析。

图1 不同色谱柱分离9 种季铵盐类化合物的总离子流图Fig.1 TIC chromatograms of nine QACs separated on three columns

2.1.2 流动相的选择

首先，考察了以甲醇作为有机相，不同酸碱度水相对色谱分离的影响。结果表明，采用纯水时，除TAHS外其余目标物峰形不佳，峰较宽。在水相中添加2 mmol/L乙酸铵溶液后峰形有所改善。采用0.1%甲酸溶液和0.1%甲酸＋2 mmol/L乙酸铵溶液时目标物峰形最好，且二者相比后者响应更佳（图2）。因此，最终选择0.1%甲酸＋2 mmol/L乙酸铵-甲醇溶液作为流动相。

图2 不同流动相对9 种季铵盐类化合物的总离子流图Fig.2 TIC chromatograms of nine QACs using different mobile phases

2.1.3 柱温的选择

考察了40、35、30 ℃柱温对目标物响应的影响。结果表明，柱温30 ℃时目标物响应与室温相比有所提高，此后，随温度上升响应不断下降（图3）。这可能是由于随温度的升高柱效先升高后降低，在30 ℃时对目标物得到最大柱效[24]。因此，将最终将柱温设置为30 ℃。

图3 不同温度对9 种季铵盐类化合物的总离子流图Fig.3 TIC chromatograms of nine QACs separated at different column temperatures

以优化后的色谱条件分析目标物，9 种季铵盐的提取离子流及总离子流色谱图如图4所示。

图4 最优色谱条件下提取9 种季铵盐类化合物的离子流色谱图及总离子流图Fig.4 Extracted ion current chromatograms and TIC chromatograms of nine QACs under optimal chromatographic conditions

2.2 质谱条件优化

将50 ng/mL季铵盐混合标准溶液注入质谱仪中，根据目标化合物的相对分子质量，设定合适的质谱扫描范围，对母离子正离子模式下的全扫描质谱进行分析，各物质的铵根离子峰响应值最高。接着，对各目标化合物依次进行子离子扫描，从而得到主要的子离子碎片，并对响应值高的子离子碎片进行碰撞能优化，确定最终的反应监测离子对、锥孔电压、碰撞能量以及相应参数（表2）。

2.3 前处理方法优化

2.3.1 提取溶剂的选择

由于目标物在不同溶剂中溶解度不同，因此选择合适的提取溶剂是保证提取效率的关键因素之一。以苹果、白菜、鱼为代表，考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、异丙醇4 种提取溶剂对水果、蔬菜、水产3 种不同基质中目标物提取效果的影响。结果表明，蔬菜中，乙腈和甲醇对目标物的提取效率相当。水果和水产中，乙腈对9 种目标物的提取效率远大于其他溶剂（图5）。综合考虑，选择乙腈作为所有基质的提取溶剂。

图5 不同提取溶剂对3 种不同基质中9 种季铵盐类化合物回收率的影响（n＝3）Fig.5 Effects of extraction solvents on the recoveries of nine QACs (n=3)

提取溶剂的体积对提取效率也有重要影响，体积过小会导致目标物提取不完全，但体积过大会导致溶剂浪费增加成本。考察了取样量为2 g时，5、10、15、20 mL乙腈对提取效果的影响，结果表明15 mL乙腈能基本完全提取水果和水产中的目标物。但对于蔬菜，使用20 mL乙腈对提取效率有明显提升（图6）。因此，提取溶剂体积确定为20 mL。

图6 不同提取溶剂体积对3 种不同基质中9 种季铵盐类化合物回收率的影响（n＝3）Fig.6 Effects of extraction solvent volume on the recoveries of nine QACs from three food matrices (n=3)

2.3.2 净化条件

水果、蔬菜、水产基质中含有大量的有机酸、色素、脂质等物质，会造成ME，对目标物分析产生影响，因此需对提取液净化。季铵盐在有机溶剂中以阳离子形式存在，目前标准及文献中多采用阳离子交换固相萃取柱对其进行净化[14,22,25-26]。因此，本研究首先考察了强阳离子交换固相萃取柱（SCX）、弱阳离子交换固相萃取柱（WCX）、混合型阳离子交换固相萃取柱（MCX）和通用的亲水亲脂平衡固相萃取柱（HLB）的净化效果。结果表明，对于3 种基质而言，与其他3 种固相萃取柱相比，使用WCX柱时目标化合物回收率略高，但依然无法达到50%，需进一步优化洗脱液pH值、流速及缓冲液离子强度等条件，操作繁琐。QuEChERS法利用基质分散固相萃取的原理，使吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到净化的目的，具有快速、简便的优点。因此，之后考察了以PSA和GCB为吸附剂时QuEChERS法对食品基质的净化效果，并与固相萃取柱的净化结果进行比较。结果表明，QuEChERS法能够大大减少目标物的损失，同时净化效果满足要求，初步选择QuEChERS法对样品进行净化。

根据文献报道，QuEChERS法中使用的GCB吸附剂在去除杂质的同时，也会对季铵盐产生吸附，从而影响目标物的回收率[27]。因此，进一步考察了5、10、20、40 mg GCB对目标物回收率的影响。结果表明（图7），GCB用量增加会导致回收率急剧下降。对大部分目标物而言，5 mg GCB能够有效去除基质中色素等物质干扰，且对回收率影响较小。PSA和无水MgSO4的用量对目标物回收率影响较小，综合考虑后确定净化环节无水MgSO4、PSA和GCB的用量分别为2 g、400 mg和5 mg。

图7 GCB用量对3 种不同基质中9 种季铵盐类化合物回收率的影响（n＝3）Fig.7 Effect of GCB dosage on the recoveries of nine QACs from three food matrices (n=3)

2.4 方法学评价

2.4.1 ME考察

ME是ESI源容易出现的问题，严重的ME会影响定量方法的灵敏度和准确性，因此需要对方法的ME进行评价[28]。通过比较基质配制标准曲线斜率与纯溶剂标准曲线斜率判定ME。若ME值低于-20%表现为基质抑制效应，ME值介于-20%～20%之间表现为弱ME，ME值高于20%表现为基质增强效应[29]。由表3可知，C12-BAC在蔬菜、水果、水产中以及DTAB在水产中存在基质增强效应。消除ME的方法主要为基质匹配标准溶液法和同位素内标法，考虑到各化合物之间性质各异，同位素内标无法完全对应，且价格高昂，选择基质匹配外标曲线对样品中的分析物进行定量分析[30]。

表3 9 种季铵盐类化合物在蔬菜、水果、水产中的METable 3 Matrix effects of nine QACs in fruits,vegetables and aquatic products

2.4.2 线性范围、检出限及定量限

制备系列基质匹配混合标准溶液，以定量离子峰面积为纵坐标（y），以对应质量浓度为横坐标（x），建立基质匹配标准曲线。在空白基质中采取低水平添加，以3 倍和10 倍信噪比对应的质量浓度作为各方法的检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）。结果表明，9 种季铵盐化合物在2～200 μg/L范围内线性关系良好，决定系数（R2）＞0.99（表4）。蔬菜和水果中9 种季铵盐LOD为0.2～1.0 μg/kg，LOQ为1.0～5.0 μg/kg；水产中9 种季铵盐LOD为0.5～5.0 μg/kg，LOQ为1.0～10 μg/kg。

表4 9 种季铵盐类化合物的线性方程、决定系数、检出限及定量限Table 4 Calibration curve equations,R2,LODs and LOQs for nine QACs

2.4.3 回收率及精密度

在3 种空白基质中进行9 种季铵盐混合标准溶液的加标回收实验，加标水平为目标物LOQ的1、2 倍和10 倍，每个质量浓度平行测定6 次，计算回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。结果显示，9 种季铵盐在蔬菜、水果、水产中的回收率为65.24%～118.63%，RSD为0.19%～6.77%（表5），表明该方法具有良好的回收率及精密度。

2.5 北京市市售样品中季铵盐含量分析

市售样本检测能够反映食品中季铵盐残留污染情况。采用本研究建立的方法对北京市市售样本进行测定，结果发现，69 份市售样品中检出季铵盐阳性样品21 份，总检出率为30.43%。在李子样品中检出C12-BAC，含量为8.84～11.56 μg/kg。在黄瓜、圆白菜、西葫芦、香蕉、车厘子、白菜、圣女果样品中检出DODMAC，含量为1.01～3.31 μg/kg，其中含量最高的样品为白菜，含量为3.16～3.31 μg/kg（表6）。欧盟食品安全局对食品中BAC和DDAC的残留量进行监测，数据显示BAC（以C12-BAC～C16-BAC之和计算）在水果样品中最高含量可达14.4 mg/kg，DDAC在动物产品中含量可达3.64 mg/kg[5]，而北京市食品中BAC检出含量远小于欧盟报告，同时未检出DDAC。这或许表明BAC和DDAC在我国食品中的残留情况好于欧盟。此外，在多个北京市食品样品中检出DODMAC，目前国际上尚未对该化合物提出限量或开展监测。DODMAC在欧洲商业消毒剂配方中较少使用[31]，但为我国使用较多的季铵盐消毒剂成分[32]，因此该化合物残留问题值得引起重视。同时，该结果能够为制定季铵盐限量标准提供参考。

表6 市售样品中季铵盐类化合物阳性检出结果Table 6 Contents of QACs in commercial food samples in Beijing

2.6 北京市膳食样品中季铵盐含量分析

膳食研究是世界卫生组织推荐的用于研究和评估某一人群烹调加工过的、处于可食状态的代表性膳食摄入的各种膳食化学成分的方法，是目前国际上公认的评价一个国家或地区大规模人群膳食中化学残留物摄入量最为有效的方法[33]。采用本研究建立的方法对北京市蔬菜、水果、水产3 类膳食样品进行测定，从而评估食品中季铵盐残留对北京市人群的健康风险。结果发现，25 份膳食样品中检出季铵盐阳性样品3 份，检出率为12%，主要检出物质为C14-BAC、C16-BAC、DODMAC、DDMOAC、DTAB和DB。其中，在茄子中检出C14-BAC和DTAB，海带中检出C16-BAC、DODMAC和DDMOAC，梨中检出DB（表7）。

表7 膳食样品中季铵盐类化合物阳性检出结果Table 7 Contents,average daily intake and EDI of QACs in dietary samples in Beijing

使用EDI评估膳食样品中季铵盐残留对人体的健康风险，其中，居民日均消费量来源于第六次总膳食研究北京市居民膳食消费量调查结果，茄子、海带和梨的消费量分别为36.98、6.03 g和11.00 g，人群平均体质量按中国人均体质量63 kg计算[34]。季铵盐残留在不同样品中的EDI见表7。与欧盟建议的BAC（以C12～C16BAC之和计算）ADI相比[35]，本研究所得EDI较小，同时其他季铵盐残留的EDI也处于较低的水平，说明北京人群季铵盐膳食暴露风险低，在可接受范围内。

3 结论

本研究建立了QuEChERS-UPLC-MS/MS对蔬菜、水果、水产中9 种季铵盐类消毒剂的检测方法，填补了DDMOAC和DODMAC两种化合物在食品检测方法方面的空白。通过对提取方法、净化条件、仪器方法等方面进行优化，最终选择20 mL乙腈提取，2 g无水MgSO4除水，400 mg PSA、5 mg GCB净化，基质匹配外标法定量。该方法操作简便、灵敏度高、精密度良好，满足食品中9 种季铵盐类消毒剂定量分析要求。采用本方法对北京市市售样品中季铵盐含量进行分析，以调查残留情况，结果发现北京市食品中季铵盐残留普遍低于欧盟报道，但在多个样品中检出DODMAC，这可能与我国消毒剂使用习惯相关，建议进一步进行风险监测并推动有关标准的建立。采用本方法对北京市膳食样品中季铵盐含量进行分析，以评估膳食摄入风险，结果发现北京人群季铵盐膳食暴露风险低，在可接受范围内。