鼠李糖脂抑制芽孢态蜡样芽孢杆菌的活性及机制

牛永武，乔 杉，孙艺铭，王雨辰，赵仁勇，田双起,*

（1.河南工业大学粮油食品学院，河南 郑州 450001；2.河南工业大学 小麦和玉米深加工国家工程研究中心，河南 郑州 450001）

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种常见的食源性致病菌，可以通过污染面制品、乳制品等食品引起成人和婴幼儿食物中毒，危害人体健康[1]。研究表明，B.cereus能够以营养细胞、芽孢和生物被膜3 种形态广泛存在于土壤、水、空气、食品等各种环境中[2]。其中，芽孢态B.cereus是其营养细胞在营养不足或外界环境胁迫条件下形成的休眠体，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和多种化学毒性物质均有很强的抗逆性[3]。芽孢的代谢活性低，但可持续监测周围环境的营养状况，一旦养分充足便可快速萌发[4]。目前，巴氏杀菌、辐照等物理杀菌技术和以食品防腐剂为核心的化学抑菌方法是食品生产中常用的微生物杀灭和抑制手段[5]，对灭活有害微生物、确保食品质量安全起到关键作用。Juneja等[6]发现温度从90.5 ℃升至99.0 ℃，可以使B.cereus芽孢数量降低2.53 个对数值。Ansari等[7]在热处理的基础上联合超声对食物中枯草芽孢杆菌芽孢进行控制，发现100 ℃、振幅114 µm、1.1 W/mL条件下处理5 min，芽孢失活数量增加1.8 个对数值。然而，加热处理并不适用于对多种食品加工中的杀菌保鲜，而当前的非热处理等物理杀菌技术大多还停留在实验室阶段[8]。因此，寻求新型的芽孢抑菌剂对预防食品中的芽孢污染具有重要意义。

随着消费者食品健康意识的增强，具有绿色、安全无毒等特点的天然食品抑菌剂替代化学合成抑菌剂成为当前的发展趋势[9]，挖掘开发新的天然抑菌剂逐步成为研究热点[10]。鼠李糖脂（rhamnolipids，RLs）是由铜绿假单胞菌发酵合成的次级代谢产物，是一种天然的阴离子糖脂类表面活性剂[11]，具有抑菌、乳化、抗癌等多种理化特性和生物学活性[12]。其中，RLs的抑菌活性早在1971年被发现[13]，其生物降解等安全性评价在2004年也已经完成。Dusane等[14]研究发现，RLs浓度低于1.6 mmol/L时可以抑制短小芽孢杆菌的生长。de Freitas Ferreira等[15]证实RLs可以使金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌和B.cereus等食源性病原菌失活，抑菌机制主要是破环菌体细胞膜，使其通透性发生改变，造成大量胞内物质外泄，引发菌体死亡[16]。近年来，研究人员还对RLs抑制细菌生物被膜形态进行了探究，发现RLs可以有效抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成，且呈现出剂量依赖效应[17]。Bertuso等[18]发现质量浓度为3.13 mg/mL的RLs可以显著抑制B.cereus芽孢的生长。随后，该团队选择芹菜籽油树脂和柠檬烯与RLs联合处理B.cereus芽孢，将芽孢抑制率从73%提升至98%[19]。但关于RLs对B.cereus芽孢的抗菌机制仍鲜见研究。

基于此，本研究以常见食源性致病菌——B.cereus的芽孢为研究对象，以抑菌圈、生长曲线、菌体外观形态、芽孢渗透性、相对电导率、生物大分子泄漏量、活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量、表面疏水性、吡啶-2,6-二羧酸（dipicolinic acid，DPA）释放量以及DNA紫外光谱为评价指标，探究RLs对B.cereus芽孢的抑菌活性和作用机理，以期为推动RLs作为抑菌剂在食品工业领域的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

B.cereus北京保藏生物科技有限公司

RLs（纯度≥90%）湖州紫金生物科技有限公司；蛋白胨、牛肉粉、琼脂 北京奥博星生物技术有限责任公司；ROS测试盒、细菌基因组DNA提取试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）安徽酷尔生物工程有限公司；其他试剂（均为分析纯）上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

营养琼脂培养基（蛋白胨5.0 g/L、牛肉膏3.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、琼脂15.0 g/L，pH 7.0）、营养肉汤培养基（蛋白胨5.0 g/L、牛肉膏3.0 g/L、氯化钠5.0 g/L，pH 7.0），121 ℃高压灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

AB204-S型分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；ZHJH-C1109C超净工作台 上海智城分析仪器制造有限公司；YXQ-LS立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司；Vortex-2 Genie涡旋振荡器 美国Scientific Industries公司；SevenEasy S20 pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；5424高速离心机 德国Eppendorf公司；UV-2550紫外分光光度计 日本岛津公司；HH-4数显恒温水浴锅 上海华燕医疗器械有限公司；ZQZY-C8振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司；SPARK酶标仪 瑞士Tecan公司；Revolve FL荧光倒置显微镜美国Echo Laboratories公司；Nova NanoSEM 450场发射扫描电镜 美国FEI公司；Mini-Protean®Tetra小型电泳套装、GelDoc Go凝胶成像分析仪 美国伯乐公司；Freezone 6L真空冷冻干燥机 美国Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢悬液制备

制备1.0×107CFU/mL的B.cereus营养细胞菌液，取100.0 μL涂布在含0.05 g/L四水合硫酸锰的营养琼脂培养基上，37 ℃培养7 d诱导芽孢形成，超净工作台中用灭菌后的载玻片将平板表面的芽孢轻轻刮下，悬浮于无菌水中。4 ℃、6 000 r/min条件下离心10 min，弃上清液，用无菌水洗涤3 次，将芽孢重新悬浮在无菌水中，80 ℃水浴处理20 min杀死营养细胞。取一滴菌悬液于载玻片上，用5%的孔雀石绿溶液染色5 min，再用水冲洗，显示青绿色即表明芽孢制备成功。将芽孢菌液调整至浓度1.0×107CFU/mL，置于-20 ℃条件下1 d后使用[20]。

1.3.2 抑菌活性的评价

最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）的测定：分别配制RLs质量浓度为0.0、16.0、32.0、64.0、80.0、96.0、112.0、128.0、144.0、160.0、256.0、512.0 mg/L的营养肉汤培养基，按50.0 mL摇瓶进行分装，以不含RLs作为对照组。按2%（以体系体积计，下同）芽孢菌液接种，37 ℃、180 r/min条件下培养48 h，测定OD600nm，与初始OD600nm相比变化小于5%的实验组RLs浓度为对B.cereus芽孢的MIC。

最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）的测定：配制营养琼脂培养基，从MIC测定实验组中分别取100.0 µL均匀涂布于固体平板，与对照组相比，菌落数降低3 个数量级的实验组所对应最低RLs浓度为MBC。

抑菌圈实验：配制RLs质量浓度分别为MIC、MBC的溶液，吸取100.0 µL芽孢菌液均匀涂布于固体平板上，在培养基表面放置已灭菌的空牛津杯，并向牛津杯中加入200.0 µL不同质量浓度的RLs溶液，以无菌水作为对照组，37 ℃培养24 h后，观察是否有抑菌圈生成。

生长曲线的绘制：分别配制RLs质量浓度为0（对照）、MIC和MBC的液体培养基，将芽孢菌液按2%接种，37 ℃条件下培养，每2 h测定OD600nm，绘制芽孢生长曲线。

1.3.3 扫描电镜观察

在制备好的芽孢菌液（1.0×106CFU/mL）中加入RLs，使其终质量浓度分别为MIC和MBC，37 ℃、180 r/min孵育6 h，4 ℃、6 000 r/min离心10 min收集菌体，无菌0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.2～7.4）洗涤2～3 次。加入体积分数2.5%戊二醛溶液，于4 ℃过夜固定，依次用体积分数30%、50%、70%、90%乙醇溶液梯度脱水，100%乙醇脱水两次，再用乙醇-叔丁醇（2∶1、1∶1，V/V）、100%叔丁醇置换，制成叔丁醇芽孢菌液，滴加叔丁醇菌液于铝箔纸上，-80 ℃预冷后冷冻干燥，采用扫描电镜观察并拍照。

1.3.4 芽孢内膜通透性的测定

芽孢渗透性分析：芽孢菌液（1.0×106CFU/mL）中加入RLs，终质量浓度分别为MIC和MBC，对照组加入同体积的生理盐水（质量浓度为9.0 g/L），37 ℃处理6 h后取样，离心收集菌体，用等体积生理盐水重悬。加入浓度为30 μmol/L的PI，避光反应10 min后，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，弃去上清液，等体积生理盐水重悬芽孢菌体，取3.0 μL菌液置于荧光倒置显微镜下观察并拍照。

芽孢菌液胞外电导率的测定：参照Zhang Yunbin等[21]的方法，取芽孢菌液离心，用质量分数5%葡萄糖溶液清洗芽孢菌体，使其电导率与5%葡萄糖溶液的电导率相同，此时的芽孢菌液为等渗菌液。分别加入MIC和MBC的RLs，对照组加入等体积生理盐水，测定电导率并记为L1。取等渗菌液分别加入MIC和MBC的RLs或生理盐水，37 ℃振荡培养8 h，每2 h取样离心并测定上清液的电导率，记为L2。将培养8 h的菌液121 ℃灭菌30 min，冷却后离心，测定上清液电导率，记为L0。菌液相对电导率按式（1）计算：

芽孢内大分子释放量的测定：利用紫外吸光光度法检测核酸和蛋白等大分子的外泄情况，取50.0 mL芽孢菌液（1.0×106CFU/mL），分别加入MIC、MBC的RLs，对照组加入相同体积的生理盐水，在37 ℃、180 r/min条件下培养，分别在0、2、4、6、8 h时取出2.00 mL菌液，利用0.22 μm微孔膜过滤，测定滤液的OD260nm和OD280nm。

1.3.5 芽孢ROS含量的测定

取50.0 mL芽孢菌液（1.0×106CFU/mL），加入MIC、MBC的RLs，对照组加入相同体积的生理盐水，在37 ℃、180 r/min条件下培养，分别在0、30、60、90、120 min时取出200.0 μL菌液，按照ROS检测试剂盒说明书操作，利用酶标仪检测各组样品滤液的荧光强度。

1.3.6 芽孢DPA释放量的测定

在0.5 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 5.5）中加入抗坏血酸（终质量浓度为1 g/100 mL）和硫酸亚铁铵（终质量浓度为1 g/100 mL）配成显色剂。样品前处理同1.3.5节，4 ℃、6 000 r/min离心15 min，取4.00 mL上清液与1.00 mL显色剂混合，测定OD440nm，利用标准曲线计算得到各组样品中的DPA含量（标准曲线方程为y＝0.001 9x＋0.048 8，R2＝0.991 1）。

测定未处理芽孢的DPA总量，取5.00 mL未处理芽孢悬液经121 ℃、30 min高温高压处理，冷却后加1 mol/L醋酸溶液0.10 mL静置1 h。离心，取4.00 mL上清液测定DPA含量，即为对照组。

1.3.7 芽孢表面疏水性的测定

利用芽孢对正十六烷的亲和力测定其疏水性。样品前处理同1.3.5节，分别取对照组和RLs处理组的芽孢菌液3.00 mL，与0.60 mL的正十六烷混匀，涡旋振荡20 s后静置10 min。对照组的芽孢菌液OD600nm记为A0。取水相再次测定OD600nm，记为A1，以疏水芽孢比例（ratio of hydrophobic spores，RHS）表征芽孢表面疏水性，按式（2）计算：

1.3.8 紫外光谱扫描测定芽孢DNA

按照细菌基因组DNA试剂盒提取方法提取芽孢基因组DNA，用Tris-HCl溶液（0.1 mol/L、pH 8.0）稀释至1.00 mL，DNA溶液中分别加入MIC、MBC的RLs，以未添加RLs处理为对照组，于37 ℃反应30 min，在220～400 nm波长范围内进行紫外光谱扫描。

1.4 数据统计与分析

无特别说明，以上实验均为3 次重复。用Origin 8.0软件绘制曲线图，用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析，以P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 RLs对B.cereus芽孢的抑菌活性评价

MIC和MBC分别可以反映抑菌剂对特定微生物的抑制和杀灭效果，是开发新型抑菌剂常用的评价指标。分别利用吸光光度法和平板涂布法测定RLs对B.cereus芽孢态的MIC和MBC，结果见图1。如图1A所示，添加RLs质量浓度为0～64.0 mg/L时，接种芽孢态B.cereus培养48 h后，培养液的OD600nm增长均远超过5%。RLs质量浓度达到80.0 mg/L时，接种芽孢态B.cereus培养48 h后，培养液的OD600nm为0.104 8，与初始OD600nm（0.100 6）相比仅增加4.17%（＜5%），故确定RLs对芽孢态B.cereus的MIC为80.0 mg/L。将对照组和添加不同质量浓度RLs培养后的菌液进行平板涂布（图1B），发现RLs质量浓度达到160.0 mg/L时，菌落总数降低3 个数量级，即160.0 mg/L RLs对芽孢态B.cereus的杀死率达99.9%。因此，确定RLs对芽孢态B.cereus的MBC为160.0 mg/L。

图1 RLs抑制B.cereus芽孢生长的MIC（A）和MBC（B）Fig.1 MIC (A) and MBC (B) of RLs against B.cereus spores

如图2所示，未添加RLs的芽孢在0～2 h处于延滞期，随后进入对数生长期，10 h后达到稳定期。加入1/2 MIC的RLs后，芽孢的延滞期延长至4 h，随后进入生长对数期，但生长速率减缓，10 h后达到稳定期。RLs质量浓度为MIC时，24 h内培养液持续呈澄清状态，芽孢生长被完全抑制，这与RLs抑制金黄色葡萄球菌的研究结果[15]相似。为进一步验证RLs对B.cereus芽孢的抑制作用，采用牛津杯法进行抑菌圈实验，结果如图3所示，MIC和MBC对B.cereus芽孢抑菌圈直径分别为（9.77±0.09）mm和（11.29±0.31）mm，表明具有良好的抑菌效果。

图2 RLs对B.cereus芽孢生长的影响Fig.2 Effect of RLs on the growth of B.cereus spores

图3 不同质量浓度RLs对B.cereus芽孢的抑菌效果Fig.3 Bacteriostatic effect of different concentrations of RLs on B.cereus spores

2.2 RLs对B.cereus芽孢形态的影响

如图4所示，未经RLs处理的芽孢呈短杆状，表面有轻微皱缩，整体较为饱满但无明显异常变化。经MIC RLs处理后，部分芽孢表面出现褶皱和折痕，而经MBC RLs处理后的大部分芽孢表现出严重的皱缩和凹陷，且表面有泄漏的芽孢内容物，表明一定质量浓度RLs会引起B.cereus芽孢外壁破损，破坏细胞膜的完整性，导致内容物泄漏，起到抑制芽孢生长或灭活的效果。

图4 扫描电镜观察RLs对B.cereus芽孢形态的影响（×40 000）Fig.4 Effect of RLs on the morphology of B.cereus spores observed by SEM (× 40 000)

2.3 RLs对B.cereus芽孢内膜通透性的影响

当菌体死亡或细胞膜通透性改变时，PI染料能进入细胞与DNA结合，荧光显微镜观察结果可以间接反映细胞膜通透性变化[22]。由图5可知，对照组在显微镜下无荧光现象，表明PI未进入B.cereus芽孢内部，细胞生长状态正常。芽孢经MIC和MBC的RLs处理后均观察到红色荧光，且MBC条件处理后的细胞红色荧光显著增强，表明RLs可以改变芽孢内膜通透性，且破坏程度与RLs浓度呈正相关。

图5 B.cereus芽孢的荧光显微镜分析Fig.5 Fluorescence microscopic images of B.cereus spores

相对电导率是衡量细胞膜渗透性的指标之一，数值上升表明菌液中电解质增加，即细胞膜破损程度更加严重[23]。如图6所示，所有组的芽孢菌液相对电导率随时间延长均有所升高，但对照组在4 h后基本不增加，而MIC和MBC RLs处理的芽孢菌液相对电导率呈现持续升高趋势，其中MBC组升高趋势更为显著。8 h时，MIC组相对电导率达到了20.86%，MBC组升至32.13%，进一步证实了RLs可以改变B.cereus芽孢内膜通透性，引起芽孢内电解质的泄漏。

图6 RLs对B.cereus芽孢相对电导率的影响Fig.6 Effect of RLs on relative conductivity of B.cereus spores

2.4 RLs对B.cereus芽孢内大分子释放的影响

蛋白质和核酸是细胞的重要大分子物质，对菌体生长繁殖起决定性作用[24]，测定不同处理时间后的芽孢溶液OD260nm和OD280nm，可以判断芽孢内核酸和蛋白质的泄漏情况。由图7可知，对照组的OD260nm和OD280nm呈现较低水平，而RLs处理后的芽孢菌液OD260nm和OD280nm明显升高，且随着RLs浓度增大和作用时间延长而提升，表明RLs对芽孢各层的通透性和完整性有明显的破坏作用，导致核酸和蛋白质大量外泄，引起功能紊乱，影响芽孢生长。黄现青等[25]探究了表面活性素对B.cereus壁膜通透性的影响，发现150 μg/mL的surfactin显著提高了芽孢核酸释放量，与本研究结果一致。

图7 RLs对B.cereus芽孢核酸和蛋白质泄漏量的影响Fig.7 Effect of RLs on the leakage of nucleic acids and proteins in B.cereus spores

2.5 RLs对B.cereus芽孢内ROS的影响

ROS是氧正常代谢的天然副产物，在细胞信号传导和体内平衡中具有重要作用[26]。细胞受到外界的不良刺激时，ROS水平会急剧上升，表现出氧化应激现象[27]。如图8所示，RLs处理60 min后，滤液的荧光强度开始显著升高，且MBC处理组的荧光强度始终高于MIC组，表明RLs可以导致B.cereus芽孢产生氧化应激反应，引起芽孢发生不可逆损伤和死亡。Gut等[28]发现Nisin处理炭疽芽孢杆菌芽孢后同样使其ROS大量增加，造成氧化应激现象。

图8 B.cereus芽孢内ROS含量的变化Fig.8 Changes in ROS content of B.cereus spores

2.6 RLs对B.cereus芽孢内DPA释放的影响

DPA是芽孢的核心组成成分，自身释放会导致芽孢抗性降低[29]，测定DPA的释放量可以评价芽孢的抵抗能力[30]。未处理的菌液经过121 ℃加热20 min后，芽孢内DPA全部释放，此时测得芽孢内DPA的总量为（166.83±1.44）μg/mL。由图9可知，RLs处理会引起DPA的释放，且高质量浓度的RLs促使DPA释放量达到（86.11±2.01）μg/mL，约占总量的51.61%，表明RLs可以有效降低芽孢的耐热性，从而加速芽孢损伤和失活。Dong等[31]选择十六烷基三甲基溴化铵处理枯草芽孢杆菌芽孢，发现十六烷基三甲基溴化铵通过激发菌体释放大量DPA进而导致菌体失活，与本研究结果类似。

图9 B.cereus芽孢内DPA含量的变化Fig.9 Changes in DPA content of B.cereus spores

2.7 RLs对B.cereus芽孢表面疏水性的影响

表面疏水性是决定芽孢黏附性的重要影响因素之一[32]。根据表1可知，未经处理的B.cereus芽孢的RHS 59.938%，表现出较强的疏水性。而经RLs处理后，芽孢RHS显著降低，MIC组降低至12.310%，MBC组下降至10.792%，分布在正十六烷中的芽孢比例显著降低，芽孢表面由疏水向亲水转变。表明RLs可以降低芽孢与疏水表面和界面黏附能力，为减少B.cereus芽孢在食品加工中的污染提供潜在可能。

表1 RLs对B.cereus芽孢表面疏水性的影响Table 1 Effect of RLs on surface hydrophobicity of B.cereus spores

2.8 RLs对B.cereus芽孢DNA的影响

由以上结果可知，RLs具有透过芽孢内膜进入内部结构的潜力，猜测其可能与DNA发生作用，利用紫外光谱探究RLs与DNA之间的相互作用。从图10可以看出，B.cereus芽孢DNA的最大紫外吸收峰随着RLs处理质量浓度的增加呈降低趋势，发生减色效应，表明RLs可以与B.cereus芽孢DNA分子发生作用。分析原因可能是RLs作为小分子物质竞争性地插入DNA的碱基对中，致使碱基对脱落，进而降低紫外吸光度[33]。

图10 DNA与RLs作用后的紫外光谱变化Fig.10 UV absorption spectra of RLs interacting with DNA

3 结论

本实验针对RLs对B.cereus芽孢的抑菌活性及芽孢壁膜的破坏作用展开研究，发现RLs可以有效抑制芽孢态B.cereus的生长，MIC和MBC分别为80.0 mg/L和160.0 mg/L，具有良好的抑菌活性。进一步研究RLs对芽孢态B.cereus的抑制机制，发现RLs处理后引起芽孢出现严重皱缩、凹陷和内膜破裂，导致芽孢内容物外泄。同时，RLs对芽孢内膜通透性和完整性均发生破坏，引起芽孢内电解质、核酸以及蛋白质等生物大分子物质的大量泄漏，导致芽孢的正常新陈代谢紊乱甚至失活。此外，RLs处理促使芽孢核心内的DPA大量释放到外界环境中，显著降低了芽孢抗性。RLs处理后的芽孢内ROS大量堆积，表现出氧化应激现象，降低菌体的代谢活性。RLs能够有效降低芽孢的表面疏水性，从而降低其黏附能力，还可以与芽孢DNA相互作用并发生减色效应，导致菌体DNA结构受损，对DNA的功能造成干扰。

整体来看，本研究从细胞水平阐述了RLs对B.cereus芽孢形态的抑菌效果及机理，揭示了RLs可有效灭活芽孢的萌发，并对其各层结构均产生破坏作用；同时，RLs可以通过降低芽孢黏附性及热抗性、加速胞内大分子物质外泄、产生氧化应激反应等多种途径对芽孢造成损伤，可为RLs的抑菌研究提供理论依据。目前，为减少抑菌剂的使用量，多种杀菌技术联合应用已逐步成为杀菌行业的关注点，后续可以对RLs与其他抑菌剂或物理抑菌方法的联合应用展开深入研究。