生物胺快速精准检测方法的研究进展

陈海新,孔祥媛,孔令灿,3*

(1.南京医科大学 公共卫生学院,南京 211166;2.山东省曲阜市中医院,曲阜 273100;3.南京医科大学附属无锡市疾病预防控制中心,无锡 214023)

生物胺(BAs)是一类具有生物活性的含氮小分子,它是氨基酸在一定条件下发生脱羧反应或者醛酮类物质通过复杂反应转化形成的[1]。多项研究发现,在肉类[2]、鱼类[3]、豆制品[4]、奶酪[5]、酒类[3]、泡菜[6]、豆瓣酱[7]、茶叶[8]等食用物质以及血液[9]、尿液[9-10]、脑脊液[11]等生物样本中均有BAs检出。一方面,在食用物质中,除了精胺(SPM)和亚精胺(SPD)外,其他多种BAs均需要微生物的参与才能产生,因此BAs含量的变化在一定程度上可以反映食品微生物污染状况和食品的新鲜程度[12]。另一方面,BAs在蛋白质的合成以及DNA的复制过程中起着重要作用,因此对生物体是有益的;然而,过量的BAs能够引起食物中毒、腹泻以及心动过速等症状,对生物体又是有害的[13]。进一步研究发现,多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)、腐胺(PUT)、亚精胺等含量可以为癌症[14-16]、妊娠糖尿病[17]、骨折[18]等疾病的诊断提供依据。因此,建立快速、准确、绿色的BAs检测方法对保障食品质量和安全、诊断和治疗疾病具有重要意义。本工作对BAs的种类和性质、BAs样品前处理技术和检测方法的最新进展进行了综述。

1 生物胺的种类和性质

BAs按来源可分为外源性生物胺[组胺(HIS)、酪胺(TYR)、腐胺、尸胺(CAD)、色胺(TRY)、β-苯乙胺(PHE)、亚精胺和精胺等]和内源性生物胺(多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素和5-羟色胺等),这些生物胺主要是通过发酵菌群和酶的催化作用协同诱导氨基酸发生脱羧反应形成的[13]。组胺和酪胺是组氨酸和酪氨酸发生脱羧反应形成的,是目前已知毒性最大的生物胺[19]。腐胺和尸胺是由鸟氨酸和酪氨酸脱羧转化形成的,它们具有两个氨基,能够降低组胺和酪胺的分解代谢并导致组胺和酪胺的肠道吸收和毒性增强[20]。色胺和β-苯乙胺是由色氨酸和苯丙氨酸转化而来的,毒性较小,但是过量摄入会诱发偏头痛,而且可与亚硝酸盐反应生成致癌物质亚硝胺,进一步危害人体健康[21]。亚精胺和精胺具有多个氨基,是由腐胺和S-腺苷甲硫氨酸经多种酶催化形成的,在体内参与基因的转录和翻译,与细胞分裂、生长和存活密切相关,然而体内亚精胺和精胺蓄积过多,会损害肾脏和生殖系统[22]。多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素和5-羟色胺是分别经酪氨酸和色氨酸转化而来的单胺类神经递质,在大脑和神经信号传导中起着重要的作用,其水平与许多类型疾病的发生和发展相关,例如抑郁症、阿尔茨海默病、帕金森病和嗜铬细胞瘤等[23]。综上所述,检测食品和生物样本中BAs的含量对于引导人们健康饮食以及增强人们健康意识具有重要意义。

2 BAs样品前处理方法

鉴于食品和生物样本中BAs含量对食品质量与安全以及对人类疾病风险预测与诊断的重要性,这些化合物的鉴定和定量已成为一个重要的研究和发展领域。然而食品和生物样本基质复杂,必须选择适宜的前处理方法减少基质干扰以实现目标物检测信号的增强。传统的前处理方法(比如液液萃取和固液萃取)有机溶剂消耗量大、样品提取时间长且效率低,难以满足人们对食品和生物样品中BAs快速精准检测的需求。基于传统的前处理方法产生的分散液液微萃取(DLLME)、固相微萃取(SPME)、分散固相萃取(DSPE)改进了传统前处理方法的不足,具有操作简单快速、有机溶剂消耗量少、提取效率高的优点,成为了目前BAs分析研究的热点。

2.1 分散液液微萃取

DLLME是基于样品溶液、萃取试剂(与水不相溶)和分散试剂(与水相和萃取试剂混溶)组成的三元溶剂体系开发的一种新型液液微萃取技术,该技术将萃取试剂完全分散在样品溶液中以增大萃取试剂和溶液的接触面积,可以在很短的时间内达到萃取平衡[24]。这种新型萃取方法简单快速、试剂消耗少,适用于从水样中提取和预浓缩有机化合物。研究发现,萃取试剂和分散试剂的种类和体积均不同程度地影响分析物的提取效率和提取时间,然而目前DLLME大多存在着萃取试剂毒性大、分散试剂选择难的问题[25],为了解决这些问题,研究人员将低毒性的萃取试剂、超声技术以及环保且不需要分散试剂的新型溶剂[离子液体(ILs)、共晶溶剂(DES)]引入DLLME中。

2.1.1 超声辅助分散液液微萃取

超声辅助分散液液微萃取(UAD-DLLME)是一种快速、高效的样品提取方法,近年来广泛应用于复杂基质中BAs的提取。比如,HE等[26]以UAD-DLLME为样品前处理方法,采用超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS),实现了酒、奶酪、香肠、鱼中生物胺和氨基酸的高效测定。首先,将样品溶液调节至pH 9.2,再加入衍生试剂(4′-甲酰氯罗丹明)、萃取试剂(溴苯)、分散试剂(乙腈)进行振荡混合、水浴超声、离心分离,用乙腈稀释后测定。结果显示,该方法简单快速(BAs和氨基酸的衍生和萃取过程仅需1 min),而且基质效应低(85.0%～116%)、回收率高(79.0%～126%),为复杂食品中BAs和氨基酸的检测提供了一个很好的思路。ZHAO等[27]以UAD-DLLME作为前处理方法提取尿液中的神经递质,在样品中加入4′-甲酰氯罗丹明、4-溴苯甲醚、乙腈的混合物进行反应,其中乙腈为分散试剂、4′-甲酰氯罗丹明为衍生试剂,萃取后采用UHPLC-MS/MS进行检测。在该方法中,神经递质的提取可在1 min内完成,而且基质效应低(90.6%～108%)、回收率高(91.7%～105%),为尿样中神经递质的检测提供了一个很好的参考,也为一些疾病的诊断(如阿尔茨海默病)提供了数据支撑。值得注意的是,在DLLME中,超声能够加快萃取平衡过程,然而超声时间过长容易导致生物胺降解,提取效率降低,因此超声时间不宜过长。

2.1.2 基于新型溶剂的分散液液微萃取

共晶溶剂是由两种(或者3种)固体物质在一定条件下形成的类似于离子液体的溶剂,其中一种物质作为氢键受体(如季胺盐),另一个作为氢键供体(如羧酸、醇和碳水化合物)[35]。这样形成的氢键改变了单个固体之间的相互作用,导致共晶溶剂的形成。与离子液体相比,共晶溶剂的组成更加多元化,而且便宜、安全,因而在DLLME的应用方面受到越来越多的关注。比如,NEMATI等[36]在pH 5的条件下用己二酸和氯化胆碱原位制备了一种共晶溶剂,并实现了金枪鱼中BAs的同时提取,之后利用高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DVD)对BAs进行检测。该方法的回收率为82.0%～93.0%,相对标准偏差(RSD)为7.3%～7.9%,为复杂样品中BAs的提取提供了一种很好的思路。尽管目前共晶溶剂在BAs萃取方面的研究还比较少,但是共晶溶剂具有种类多、污染小以及效率高的诸多优点,相信随着共晶溶剂形成机理以及BAs提取机理的深入研究,共晶溶剂的更多应用将会开发出来。

DLLME中的萃取试剂逐渐从有毒的有机溶剂发展成为离子液体和共晶溶剂,导致生物胺的提取过程更加方便环保。然而,DLLME技术在生物胺的应用还比较局限。比如,很多有重要生物活性的生物胺还没有确定的DLLME方法,一些与特定疾病相关的生物胺(两种或者多种)也没有建立DLLME方法,更不用说利用生物胺评价疾病风险了。

2.2 固相微萃取

SPME是一种通过吸附将待测物质从样品溶液提取到SPME纤维上,再经加热(或溶剂解吸)将待测物质解吸出来的技术。该技术具有自动化程度高、基质效应低、提取效率高、精密度高、分析时间短的优点,在固体样品中BAs的提取以及大规模样本的处理方面表现良好,可与DLLME技术相互补充来提取各种基质中的生物胺。然而目前商业化的SPME纤维存在着价格昂贵、质地脆弱、选择性差、提取能力低的问题,导致了SPME发展受限[31,37]。为了弥补SPME纤维的不足,近年来发展了多种基于新型吸附材料的SPME纤维涂层,如硅基材料、共价有机骨架(COFs)、金属有机骨架(MOFs)。

硅基材料因其孔隙率高、比表面积大、化学稳定性好、可重复利用以及结构和孔径可变的特点,近年来越来越多地应用于分析物的吸附中[38]。比如,CHEN等[39]以MCM-41为基底材料制备了一种表面具有酸性基团和疏水基团的MCM-T-H-SPME纤维,并用于提取猪肉和鱼肉中的BAs衍生物,最后经热解吸后采用气相色谱-质谱法(GC-MS)进行分析。结果发现自制纤维对碱性BAs不仅具有高度的亲和力(猪肉和鱼肉BAs的回收率分别为78.5%～123%和74.6%～118%),而且具有良好的稳定性(重复使用50次仍保持良好的吸附性能)。这些数据表明MCM-T-H-SPME纤维在食品BAs的提取中具有很好的应用潜力。

COFs材料结构稳定、比表面积大,而且孔隙规则、孔隙率高,这些性能吸引着研究人员努力探索它们在吸附方面的应用。基于此,张鹏玲等[40]自制了一种COFs(COF-DL229)涂层纤维提取葡萄酒中的芳香胺(苯乙胺和酪胺),并通过GC-MS对其进行检测。结果发现COF-DL229对芳香胺的提取效率接近100%,该方法为其他食品中BAs的研究提供了一种很好的思路。然而目前关于COFs吸附脂肪胺的研究还很不足,为了扩大COFs的应用范围,COFs材料的开发和改性研究将是未来发展的一个重要方向。

MOFs,特别是其亚家族——沸石咪唑酸盐骨架(ZIFs),不仅孔隙率高、比表面积大,而且在中性和碱性溶液中的稳定性好,因此在吸附分离领域引起了人们的广泛关注[41]。比如,HUANG等[42]利用自制的ZIF-8涂层纤维提取鱼肉中的非挥发性脂肪族胺衍生物,经热解吸后进入GC-MS进行分析。结果发现,该方法不仅检出限低(27.1～33.2 μg·L-1)、回收率高(78.6%～104%),而且经济环保(纤维可重复使用30次),为鱼肉中BAs快速高效检测提供了一种很好的方法。同样地,LAN等[43]利用自制的疏水性ZIF-8涂层纤维提取废水、鲑鱼和蘑菇中的三甲胺(TMA)和三乙胺(TEA),并采用GC-MS进行检测。结果显示,整个提取过程仅需5 min,而且回收率高(91.6%～92.1%)、稳定性好(可重复使用130次)。这些结果说明MOFs涂层纤维在BAs检测中具有良好的应用前景,并为其他食品中的BAs检测提供了重要参考。

总之,新型吸附材料作为SPME纤维吸附BAs,不仅快速、灵敏、成本低,而且提取效率高、可以重复利用多次,在一定程度上解决了商业SPME纤维种类不足的问题。然而这些新型SPME纤维材料也存在着一些问题:(1)在极端pH条件下,纤维的吸附能力大幅度降低;(2)在复杂基质中(比如血和尿),纤维的选择性和灵敏度明显受限。这些问题的解决需要化学材料和公共卫生研究人员进行深入研究。

2.3 分散固相萃取

DSPE是一种快速、简单、高效、经济的样品前处理技术。与SPME相比,DSPE无需制备纤维涂层,因而材料的选择(吸附剂)更加灵活多样,一定程度上更适合在吸附富集领域进行应用。众所周知,吸附剂与BAs之间的相互作用是BAs高效吸附富集的重要因素,寻找合适的吸附剂自然成为人们提取BAs的重要研究方向。金属纳米颗粒(MNPs)、碳基材料、COFs、分子印迹聚合物(MIPs)这些新兴的吸附材料不仅具有大的比表面积、可调节的孔径结构,而且毒性低、稳定性好[44-45],在生物胺的分离和纯化方面具有很好的应用前景。

2.3.1 基于金属纳米颗粒的分散固相萃取

MNPs具有大的比表面积和强的吸附能力,但是在复杂基质中MNPs很容易形成聚集体,导致吸附能力减小,吸附选择性降低[46]。为了减弱和消除MNPs的聚集行为,研究人员在MNPs上进行了很多修饰和改性。例如,MOLAEI等[47]通过表面可逆加成断裂链转移共聚的方法对Fe3O4纳米颗粒进行表面改性,制备了磁性纳米复合材料(Fe3O4-g-GO-g-RAFT),并将其应用于熏鱼中BAs的提取。涡旋振荡后,用磁铁收集磁性吸附剂,然后用苯甲酰氯和乙腈的混合液洗脱重新产生BAs溶液,最后采用紫外检测器检测BAs。该方法溶剂消耗量少(仅用0.5 mL)、回收率高(98.6%～104%),为熏鱼中BAs的快速高效提取提供了一种很好的方法。JIANG等[48]基于化学多步共价修饰制备了氨基苯硼酸功能化的磁性纳米粒子(Fe3O4@APBA NPs),并将其应用于尿液样品中儿茶酚胺(CAs)的提取。磁性纳米粒子经过酸化甲醇溶液洗脱、氮气浓缩后,采用高效液相色谱-电化学检测器(HPLC-ECD)进行检测。结果表明CAs的检出限为2.0～7.9 μg·L-1,回收率为92.0%～108%。该方法良好的灵敏度和选择性为尿液样品中CAs水平分析提供了一种很好的检测方法。基于MNPs的DSPE显示了快速简单、经济环保、提取效率高的优势,然而MNPs制备繁琐、改性后磁性减弱等问题限制了该技术的发展。

2.3.2 基于碳基材料的分散固相萃取

常见的碳基材料(石墨烯、碳纳米管、碳纳米纤维等)对BAs的吸附效果一般不理想,通常利用-COOH、-NH2等官能团修饰或者与其他新型材料杂化的方法改性碳基材料、改善其吸附性能。比如,XU等[49]构建了一种新型三维N掺杂的磁性多孔碳材料(3DN-MPCSs),并将其作为吸附剂与衍生试剂(丹磺酰氯)一同加入样品溶液中,微波照射135 s后用乙腈洗脱BAs衍生物,并经氮气浓缩、乙腈复溶采用HPLC-UV进行分析。在该方法中,固相萃取富集以及BAs衍生同时进行,整个过程仅需要135 s,并且检出限低(0.059～0.073 μg·L-1)、回收率(92.3%～109%)和精密度(RSD小于5.9%)高、稳定性好(可重复使用10次)。因此,基于碳基材料的DSPE是一种快速、简单、高效的前处理技术,为复杂基质中BAs的分离和纯化提供了一种良好的处理技术。

2.3.3 基于共价有机骨架的分散固相萃取

张颖等[50]制备了一种共价有机骨架(CSTF-COFs),并利用该材料和含5%(体积分数)甲酸的乙腈溶液作为吸附剂和洗脱剂,对红酒中的BAs及其代谢物进行净化与富集,最后采用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)进行检测。结果发现,CSTF-COFs骨架材料对BAs的提取过程不仅时间短(2 min),而且回收率高(80.1%～107%)。同样地,WANG等[51]利用自制的COFs提取人尿中的单胺类神经递质,随后用5%(体积分数)乙酸乙酯溶液洗脱,采用HPLC-FLD进行检测。该方法提取时间为10 min,回收率为86.3%～115%。总之,基于COFs的DSPE具有操作简捷、提取效率高的优点,为复杂基质中BAs的分离和纯化提供了参考。

2.3.4 基于分子印迹聚合物的分散固相萃取

2.4 其他前处理方法

DANIEL等[54]采用毛细管电泳-串联质谱法(CE-MS/MS)检测啤酒和葡萄酒中的BAs。该方法唯一的预处理步骤是利用聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)吸附酒中的酚类化合物,而且提取时间短(3 min)、检出限低(1～2 μg·L-1)、回收率高(87.0%～113%),为酒类中BAs的检测提供了一种很好的思路。然而由于肉类、鱼类等食品以及生物样品的基质更加复杂,对BAs的准确定量干扰更大,在一定意义上限制了该方法的应用范围。

3 检测方法

目前BAs的检测方法包括液相色谱-紫外检测法(LC-UV)[3,47]、液相色谱-荧光检测法(LC-FLD)[29,30,51,53]、电化学检测法(ECD)[48]、CE-MS/MS[54]、GC-MS[39,40,42,43]、薄层色谱法(TLC)[55]、HPLC-MS/MS(或者LC-MS/MS、UHPLC-MS/MS)[26,27,31,50,52]、超高效合相色谱法(UPCC)[56]等。LC-UV和LC-FLD操作简单,但是样品通常需要衍生化,导致测定结果可重复性较差。ECD普及率高、操作简单,但是电流信号容易受到其他物质的信号干扰,因此给BAs的定性带来了一定的不确定性。CE具有分离效率高、运行成本低等优点,但是纯化的样品更适合CE检测,这一点给前处理技术带来了更高的要求和挑战。GC-MS具有灵敏度高、分离效率高的优点,然而其色谱峰容易拖尾,进而影响BAs的准确度和灵敏度。TLC可以快速分离和测定多种BAs,然而有些生物胺需要衍生化操作,进而引起样品测定的精密度降低。HPLC-MS/MS虽然价格昂贵,但是其分辨率高,无需衍生即可分析绝大部分BAs。UPCC价格昂贵、普及率低,但是其以二氧化碳和少量有机试剂为流动相,具有环保、分析时间短、分离效率高、灵敏度高、重现性好的优点,未来可能替代HPLC-MS/MS成为检测不同基质生物胺的常用技术。表1列举了生物胺的前处理技术和检测方法。

表1 生物胺的前处理技术和检测方法

4 结语与展望

近年来,研究人员开发了多种基于新型溶剂(ILs、DES)或新型吸附材料(硅基材料、COFs、MOFs、MNPs、碳基材料、MIPs、PVPP)的前处理方法,并已成功应用于食品和生物样品中BAs的提取。与基于传统萃取溶剂和吸附剂的前处理技术相比,基于新型溶剂或者新型吸附材料的前处理技术更加快速、高效、经济、环保。这些前处理技术的优势主要通过以下途径实现:(1)新型溶剂和新型吸附材料与生物胺之间的π-π 堆积、氢键、亲疏水相互作用以及静电作用,导致了BAs的高效吸附;(2)新型吸附材料大的比表面积为BAs的吸附提供了多个吸附位点,而且材料结构稳定,可以反复使用多次。然而基于新型溶剂或者新型吸附材料的前处理技术还存在着以下不足:(1)这些材料在极端pH条件和复杂基质中的选择性和灵敏度明显受限,导致它们在尿液、血液、脑脊液等复杂基质中的应用明显不足;(2)很多特定疾病相关的BAs(两种或者多种)还没有建立确定的样品前处理方法,更不用说用来预测和评估疾病风险了。因此,通过新型溶剂和新型吸附材料结构和孔径的修饰以及与其他材料的共价和非共价改性研究,增强其对生物样品中BAs的选择性吸附并用于疾病风险评估是未来前处理技术发展的重要方向。

目前,食品和生物样品中BAs的检测方法各有优缺点,在实际应用时可根据样品特点和实验室情况选择合适的方法。但是随着人们对健康需求的不断提升,建立快速、高效、灵敏、准确的BAs检测方法十分迫切,因此具有高分辨率、高灵敏度以及高通量的分析技术将是今后食品和生物样品BAs定量分析的重要方向。而且,这些检测技术和新型前处理技术的“强强联合”有望实现食品和生物样品中多种BAs的快速精准检测,可为生物体内特定BAs的水平与相关疾病的联系提供技术支撑。