九香虫水煎液经口急性毒性试验

田 莹,檀 军,赵 帅,蔡仁莲,,郭建军

(1.遵义医科大学 形态学实验室,贵州 遵义 563006;2.贵州大学昆虫研究所,贵州山地农业病虫害重点实验室,贵州 贵阳 550025;3.遵义医科大学 组织学与胚胎学教研室,贵州 遵义 563006)

九香虫(aspongopuschinensisdallas)又称打屁虫、屁巴虫、瓜黑蝽等,半翅目Hemiptera兜蝽科Dinidoridae昆虫。民间俗语“有钱吃鹿茸,没钱吃打屁虫”,部分地区人民食用九香虫作为壮阳之品[1-2]。九香虫营养丰富,蛋白质含量高,含丰富氨基酸,能为人体提供必需的氨基酸[3]。九香虫含较多不饱和脂肪酸,且含多种矿物元素和维生素,具有较高的食用和保健价值[4]。九香虫也具有较高的药用价值,《本草纲目》记载其“主治膈脘滞气,脾肾亏损,壮元阳”[5]。近代研究表明九香虫提取物有抗肿瘤、抗菌、抗凝血、镇痛、修复睾丸损伤等功效[6-10]。临床应用中,九香虫多与其他中药煎煮治疗肝癌、胃癌、胃炎等[11-12],王沛应用九香虫煎剂治疗胃癌;九香虫在临床应用多与其他中药配伍煎煮,九香岩痛宁(鼠妇、九香虫、元胡等)可治疗癌痛[13];通络亢痿汤(大蚂蚁、仙灵脾、九香虫等)治疗阳痿有较好的效果[14];九香虫汤可显著改善阴茎勃起障碍、阴茎勃起硬度和睾酮水平,恢复勃起功能[15]。九香虫水煎液成分中含有镇痛、抗菌、抗氧化及抗肿瘤物质,且能够抑制乳腺癌细胞增殖,具有广泛的应用潜力[16]。药物安全性是现代化中药新药研究的必要环节之一,不容忽视[17]。急性毒性试验为药物安全性评价实验之一,可以评价该药物的毒力大小和小鼠的耐受剂量。中药九香虫水煎液的安全性研究鲜见报道,本研究通过九香虫水煎液对昆明小鼠经口急性毒性试验,明确九香虫水煎液毒性的强弱,为长期毒性试验、遗传毒性及生殖毒性等研究提供依据,也可为九香虫安全食用和药用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料 九香虫活虫购自贵州省遵义市习水县习酒镇。

1.2 实验动物 6周SPF级昆明小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,适应性饲养1周后动物合格证号：SCXK(湘)2016-0002,饲养温度为20～25 ℃,相对湿度为40%～70%。该动物实验已获得贵州大学伦理委员会批准(NO：EAE-GZU-2020-P013)。

1.3 主要仪器和试剂 202型恒温干燥箱(北京永光明医疗仪器厂);BSM型电子天平(上海卓精电子科技有限公司);显微镜(日本尼康公司);苏木素伊红染色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,货号：C0105S);Sigma-3 K 30冷冻离心机(德国Sigma公司);RM2235组织切片机(德国徕卡公司);EG1160一体式石蜡包埋机(德国徕卡公司)。

1.4 方法

1.4.1 制备九香虫水煎液 将九香虫用纯水洗净,用滤纸吸干表面水分,置于恒温干燥箱70 ℃干燥6 h,研磨成粉末。称取适量虫粉,室温浸泡30 min,置于砂锅中煎煮并浓缩至1 g/mL。滤除虫粉,室温下6 000 g离心10 min,取上清液过滤除菌后置于4 ℃保存备用。

1.4.2 急性毒性试验 根据《中药、天然药物急性毒性研究的技术指导原则》([Z]GPT2-1),九香虫为低毒性天然药物,采用最大耐受剂量法较合理。将40只6周龄SPF级昆明小鼠随机分为对照组(normal saline, NS)和给药组(aspongopuschinensisdecoction, ACD),每组20只小鼠,雌雄各半。采用灌胃给药的方式,对照组给予0.8 mL生理盐水,给药组给予20 g/kg九香虫水煎液,给药后观察小鼠排便及活动行为30 min,每日1次,连续灌胃14 d。每两日称量小鼠体重,每日统计小鼠进食量和进水量。14 d后采用断头法采取小鼠血液,室温静置30 min,3 000 g离心15 min获取血清,检测丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酐(Cre)、尿素氮(BUN)血生化检测由湖南锋锐生物检测公司完成。取血后立即进行解剖,解剖前8 h禁食不禁水,观察各器官颜,摘除肝、脾、肺、肾、胃、睾丸(或卵巢)称重,计算脏器系数,脏器系数=(脏器重量/小鼠体重计算)×100%。将肝、脾、肾、胃、睾丸(或卵巢)固定于10%甲醛溶液,梯度浓度的乙醇溶液脱水,用二甲苯透明;其次浸蜡包埋,切片展片,HE染色封固;最后拍照,进行组织病理学分析。

2 结果

2.1 九香虫水煎液对昆明小鼠行为活动、体重及进食进水的影响 给予昆明小鼠连续灌胃20 g/kg九香虫水煎液14 d,与对照组相比,昆明小鼠日常行为活动正常,毛色和排便无异常,未出现中毒相关症状和死亡现象。给药组雌雄鼠体重分别相较于对照组雌雄鼠体重无显著差异,都呈缓慢增长的趋势(图1),两组间小鼠进食量与进水量与对照组无显著差异(图2)。

A：雌鼠;B：雄鼠。

A：进食量;B：进水量。

2.2 九香虫水煎液对昆明小鼠血生化的影响 与对照组相比,给予九香虫水煎液14 d后,小鼠血清ALT、AST、Cre、BUN含量均无显著差异(表1)。

表1 九香虫水煎液对昆明小鼠血生化指标的影响(n=10)

2.3 对小鼠器官重量及病理特征的影响 给药组与对照组相比,各器官颜色无差异,解剖后对肝、脾、肾、胃、肺、睾丸(雄鼠)或卵巢(雌鼠)称重,计算脏器系数,给药组与对照组比较,均无显著差异(图3)。对肝、脾、肾、胃、睾丸(雄鼠)或卵巢(雌鼠)切片的HE染色进行组织病理学分析,均未见病理性异常(图4)。

A：雌鼠;B：雄鼠。

3 讨论

虫类中药多具有破血逐瘀、软坚散结之功效。九香虫为虫类中药的一种,具有抗肿瘤、抗菌及壮阳等功效,同时也是一种可食用昆虫,具有丰富的微量元素及不饱和脂肪酸[1-2,8]。九香虫医用保健价值较高,成分较多,药理复杂。九香虫临床中仍以水煎液为主,水煎为传统中药用药方式,水煎液制备工艺简单,经过高温煎煮,药物稳定性较高,也可使药物活性成分充分释放和溶解于汤剂中,但其安全性研究未见报道[9]。本研究通过经口急性毒性实验评价九香虫水煎液对昆明小鼠的毒性强弱及存在中毒症状。九香虫水煎液对小鼠的体重、进食量、进水量、毛色及正常活动无影响,肉眼观察无明显的中毒反应。内脏重量一直是毒理实验中药物对脏器损伤的敏感标志[18],给予小鼠九香虫水煎液14 d后,通过称量小鼠肝、脾、肺、右肾、胃、睾丸(或卵巢),给药组小鼠各器官的脏器系数与对照组均无显著差异,表明各器官无增生肥大、充血和水肿等情况。生化参数的评估是评估器官功能的关键,尤其是肾脏和肝脏。ALT主要存在于肝细胞浆,AST主要存在于肝细胞浆和肝细胞线粒体,ALT和AST升高,预示着肝细胞收到损伤,所以ALT和AST是临床上肝细胞受损情况诊断最常用的检测指标[19-21]。实验组ALT和AST与对照组比较无显著差异,但这两个指标不能作为肝损伤诊断指标,还需结合其他指标和检查。肌酐(Cre)、尿素氮(BUN)是监测肾脏损伤严重程度及评估肾功能常用的指标[22-23]。肌酐通常形成于肌酸在肌肉中的非酶脱水反应,肌酐的量与肌肉量有关。肌酐由肾脏通过尿液从体内清除。如果肾脏清除率是受损的,血清肌酐水平高于正常[24]。尿素氮是人体蛋白质代谢的主要终末产物,尿素经肾小球过滤后经肾小管重吸收,肾功能的损伤会导致血清中尿素氮高于正常值[25]。与对照组相比,九香虫水煎液未造成Cre、BUN显著性升高,给药组小鼠肾功能无损伤。小鼠肝、脾、肾、胃、睾丸(卵巢)均无病变特征,因此本实验中九香虫水煎液对各器官未造成病理性损伤。但是否会对器官造成慢性损伤仍需长期毒性实验验证。

综上所述,急性毒性试验表明,九香虫水煎液无致死作用,对肝、肾功能无显著损伤,对小鼠脏器无明显的病理损伤。据《中国药典》记载九香虫最大用量9 g,本实验所用剂量相当于60 kg人临床用药量的133倍,一般认为小鼠最大给药量按体重计算,为人临床日用量100倍以上则较为安全[26],因此九香虫水煎液MTD(最大耐受剂量)>20 g/kg,具有较高的安全性,为临床应用提供依据。另外,九香虫水煎液的安全性还需长期毒性试验、遗传毒性及生殖毒性等进一步研究。