中药基于铁死亡机制防治肝癌研究进展

郭桓博,马瑞雪,朱正望,朱平生

(河南中医药大学,河南 郑州 450046)

肝癌是各种慢性肝脏疾病的终末阶段,有发病率高、隐匿性高、恶性程度高等特点。目前对于肝癌的治疗主要有手术治疗和放化疗,但预后均不佳,患者治疗依从性差。有研究表明,肝癌后期即使经过积极治疗也容易复发,5年生存率仅为12.1%[1]。肝癌的发病与HBV的持续性高感染密切相关,我国乙肝患者数量庞大,是肝癌发病率居高不下的原因之一[2-3]。目前,肝癌的发病呈现出低龄化趋势,由于肝癌易在肝内及肝外转移的特点,肝癌患者的生活质量及预后常较差。因此,开辟中医药防治肝癌的思路,提高肝癌患者的治疗效果,积极研究调控肝癌细胞死亡的新方式变得极为重要。

铁死亡(Ferroptosis)是由DIXON等[4]于2012年首次提出的一种新型调控细胞死亡方式,与之前已知的细胞坏死、凋亡和自噬均有所不同。铁死亡在肝癌的防治中有积极作用,通过激活肝癌细胞铁死亡,提高肝癌细胞对铁死亡的敏感性,可以导致肝癌细胞的坏死从而保护肝脏的正常功能[5-6];与此同时,抑制正常肝细胞铁死亡,减缓肝纤维化的进展,对于保护肝脏功能和预防肝癌的发生均有积极意义。现有研究表明,铁死亡与肝癌在细胞层次的病理改变上存在共同点,铁死亡极有可能成为治疗肝癌的下一个有效靶点[7]。中医药以整体观念和辨证论治为特色,其多靶点、多层次、多途径的作用方式在治疗肝癌上有独特的优势,中国古代即有对肝癌相关症状的描述,并留下许多治疗肝癌的经验用方,效果显著,且中药联合西药治疗,不仅可以降低患者接受化疗时的不良反应,还能提高疗效和患者的生存率[8-9]。研究发现,中药对干预铁死亡具有确切的价值和疗效,相关中药中的活性成分,对于铁死亡有正负相关性调节作用。

1 铁死亡发生的机制

与细胞凋亡、细胞坏死和细胞自噬不同,铁死亡在形态上主要表现为线粒体皱缩、线粒体膜密度增加等改变,其质膜与细胞核无明显变化[10]。铁死亡的过程也紧密围绕铁代谢紊乱和氧化应激激活两个方面,下文将从以上两个方面介绍铁死亡发生的机制。

1.1 铁代谢与其中医内涵 铁元素是组成人体微量元素中最为重要的其中一种,参与了体内各种蛋白质和酶的合成,负责氧气的运输、ATP的生成和DNA的合成等,正常情况下,血浆中几乎所有的铁都与转铁蛋白结合,从而避免体内铁含量过多引起组织氧化损伤,当铁代谢失衡,多余的铁在体内积累,就会导致铁死亡的发生。

铁离子(Fe3+)在铁死亡过程中发挥至关重要的作用,Fe3+在进入细胞后被还原为亚铁离子(Fe2+),会被优先形成参与生化反应的各种铁结合复合物,多余的Fe3+则在细胞中堆积,形成不稳定的Fe3+池(LIP)并增强芬顿反应(Fenton reaction),生成以羟基自由基为代表的活性氧(ROS)复合物,过量的ROS导致细胞脂膜氧化,使细胞丧失功能并死亡[11],而补充Fe3+可以加速erastin诱导的铁死亡[4]。有研究表明,铁螯合剂(DFO)能缓解由双氢青蒿素(DHA)诱导急性髓细胞白血病(AML)细胞发生铁蛋白重链(FTH)自噬降解造成的铁死亡[12]。研究还发现,热休克蛋白B(HSPB)通过抑制膜蛋白转铁蛋白受体(TFR),阻止Fe2+进入细胞内,从而降低细胞内Fe2+的浓度,抑制细胞铁死亡,这些结果从正反两方面验证了铁代谢在铁死亡中的作用[13]。

铁参与了细胞中的各项生理生化反应,由肝脏合成并分泌的铁调素在维持铁稳态中起到了重要作用[14],当因为各种因素导致体内铁的含量不能维持在一个正常的水平,肝内铁含量增加,可促进肝硬化患者向肝癌发展[15],此外过量的游离铁还可能导致免疫系统异常,使得癌化的细胞脱离免疫系统的监视。另外,肝癌细胞中的FTH和铁蛋白轻链(FLH)显著高于正常肝组织,而去铁药物甲磺酸去铁胺(DFO)可显著抑制肝肿瘤的增殖能力。

中医讲究万物平衡,五行之间相生相克,这与人体内铁元素水平的稳态息息相关。尽管中医理论中没有关于铁稳态的叙述,但中医的“肝藏血”理论,认为肝脏和血液的关系密不可分,而血液之所以呈现红色正是因为血细胞中含有的含铁血红蛋白;同时,中医还认为“肝主疏泄”,通过调节全身气机通畅,维持五脏六腑的正常生理功能不被铁死亡影响;现代医学发现肝脏分泌的铁调素在维持铁稳态中发挥了重要的作用,从另一个角度阐释了肝脏在调节铁代谢平衡中的作用。肝脏与铁这种复杂关系,表明铁的含量对肝脏的生理功能有影响,同时也说明铁死亡在肝脏疾病中扮演了重要的角色。

1.2 氧化应激与其中医内涵 细胞的正常生理活动是一个氧化与抗氧化相平衡的过程。氧化反应是给细胞提供能量的基本途径,所有的细胞活动都依赖于正常的氧化反应。氧化应激是异常的氧化反应,ROS增加导致氧化与抗氧化失衡,细胞脂质过氧化,破坏生物膜,是铁死亡的特征之一。其中线粒体作为合成ATP的场所,其中的氧化还原反应最为频繁,是ROS生成的主要部位,因此铁死亡的细胞中线粒体改变最为明显[16]。一方面细胞依赖于糖、蛋白质和脂肪的氧化反应提供能量进行生命活动;另一方面,当细胞的抗氧化能力失常,细胞中的氧化物堆积,对细胞产生氧化损伤,从而导致铁死亡,因此铁死亡的发生与氧化应激密不可分[17]。

研究表明,谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)作为清除脂质过氧化物的一种酶,若抑制GPX4的活性,会使脂质过氧化物堆积,膜脂质双分子层的稳定性遭到破坏,进而导致铁死亡的发生[18]。而谷胱甘肽(GSH)是决定GPX4活性的重要物质,缺乏GSH会导致GPX4活性降低甚至直接失活,使细胞抗氧化能力下降,逐渐发生氧化损伤[19]。胱氨酸/谷氨酸反向转运体(System Xc-)负责等比例运输细胞内外的胱氨酸和谷氨酸,用于合成GSH,当System Xc-被抑制后,GSH的含量降低,进而影响GPX4的活性。为保证物质的交换,细胞脂质膜由多不饱和脂肪酸(PUFAs)构成[20],PUFAs中疏松的C=C双键间存在极易被氧化的C-H键,C-H键中的-H被夺取将生成脂质氢过氧化物(L-OOH),因此细胞生物膜对脂质氧化高度敏感[21]。GPX4作为抗氧化物质,它的低活性会将细胞的生物膜暴露在被氧化的风险中。此外,脂氧合酶(LOX)、细胞色素P450氧化还原酶(POR)和环氧合酶(COX)等通过酶促反应也可导致细胞脂质膜过氧化,LOX和POR不能单独作用于酶促反应,常需与Fe2+共同作用[22]。当游离的PUFA被酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)催化生成PUFA-CoA,并最终在LOX和Fe2+的共同作用下生成脂质过氧化物诱导铁死亡[23]。

抗氧化与过氧化物就如同中医理论中的正邪因素,正不压邪则发病,正如过氧化物增多导致的铁死亡。同时正邪也有其相对性,肝癌细胞对人体而言就是一种内生的“邪”,氧化应激导致的铁死亡对肝癌细胞也是“邪”,但肝癌细胞的死亡对机体而言又是一种“正”。中医益气扶正的治疗方法,在铁死亡的机制上就是诱导肝癌细胞铁死亡,即扶正祛邪。正气足则精神焕发,身强体健,中药有可能是通过增强机体抗氧化的能力,同时降低肝癌细胞的抗氧化能力,从而在铁死亡机制上对肝癌起到干预效果。

2 中药基于铁死亡机制防治肝癌研究现状

中药以其多活性成分、多途径、多靶点等特点在治疗肝癌、改善患者生活质量上发挥了重大的作用。探究中药在铁死亡机制上与治疗肝癌的关系,有利于更好地发挥中药的效果。

2.1 中医对肝癌的认识以及蕴含的铁死亡机制 古籍中并未出现对“肝癌”的记载,但其症状见于“积聚”“黄疸”“鼓胀”“肝积”等疾病,如《灵枢·胀论》记载：“鼓胀何如?腹胀身皆大,大与腹胀等也”,“色苍黄、腹筋起……,胁下满而痛引下腹”,病机以虚、毒、瘀为主[24],病性为本虚标实。病理上,过量的铁可使正常的肝细胞发生铁死亡,肝受损导致肝疏泄功能失调,疏泄失调则气血津液运行不畅,进而出现血瘀、水停、气滞等实证表现。血瘀日久成聚,水停方长为积。积久化热,炼液成痰,痰瘀互结,复阻疏泄,如此往来,病情重矣。生理上,中医认为“肝藏血”,铁蛋白在肝细胞中的含量很高,同时铁蛋白是机体合成血细胞的重要基础,这与“肝藏血”理论不谋而合,同时肝脏分泌的铁调素是调节体内铁稳态的必要条件,是肝主疏泄的另一种体现。研究表明,酒精可以使肝细胞内脂质过度沉积,从而激发氧化应激和肝纤维化过程,诱导肝细胞铁死亡[25]。各类因素导致的肝细胞损伤进而纤维化最终发展为肝癌与中医的本虚标实理论存在共性,因此积极探讨中药干预肝细胞铁死亡的途径十分重要。

2.2 中药及复方在铁死亡方面对肝癌的防治

2.2.1 单味中药基于铁死亡防治肝癌的研究：李艳纯等[26]通过提取黄花蒿所含有的青蒿素,分离出其衍生物二氢青蒿素(DHA),监测DHA处理24 h后的SMMC-7721、Huh-7肝癌细胞株,发现细胞内ROS和脂质过氧化物水平均增加,胞内GSH的含量降低;若再使用DFO、铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1)、ROS清除剂(NAC)处理这两组肝癌细胞,则会使其细胞活性增强。说明DHA可以诱导肝癌细胞发生铁死亡抑制肿瘤细胞的生长。张楠[27]通过网络药理学分子对接筛选出栀子调节肝癌的关键靶点血红素加氧酶1(HMOX1),并发现栀子的关键活性成分栀子苷可以作用于HMOX1,通过ERK/Nfr2信号通路,启动氧化应激反应,进而抑制肝癌细胞的增殖活性。LAN等[28]在研究中药柴胡治疗肝癌的作用中发现,其含有的活性成分柴胡皂苷A(SsA),通过激活转录因子3(ATF3)增加肝癌细胞内丙二醛(MDA)和Fe2+的积累,而降低GSH 的水平。葫芦素B(Cu B)具有多种药理活性,在肿瘤研究中颇为广泛,研究表明,Cu B可通过抑制核因子红系2相关因子2 (Nrf2)/血红素加氧酶-1(HO-1)抗氧化系统通路降低肝癌细胞的抗氧化能力,同时引起GPX4在环己酰亚胺(CHX)存在下出现泛素化降解[29]。袁靖涛[30]以中药植物泽兰抗肿瘤有效成分EChLESs为研究对象,发现EChLES能延缓核受体共激活因子4(NCOA4)的降解,使得大量的Fe2+从靶向铁蛋白中分解出来,与细胞内的过氧化物促成Fenton反应,进一步使得GPX4失活。刘金丽等[31]通过观察隐丹参酮对体外培养人肝癌HepG2细胞的作用,发现其可显著诱导HepG2细胞降低GSH水平,积累ROS,并下调xCT和GPX4表达,导致HepG2细胞铁死亡。甘草的活性成分异甘草酸镁在治疗肝纤维化上效果显著,一项对肝纤维化大鼠的研究中显示,异甘草酸镁可以通过HO-1介导显著降低CollagenⅠ的表达,使异常的肝细胞内Fe2+水平增加,提示异甘草酸镁在引导异常的肝细胞铁死亡,抵抗肝纤维化的进程[32]。

2.2.2 中药复方基于铁死亡防治肝癌的研究：ZAO等[33]研究了中药复方抗纤抑癌方对肝癌模型大鼠的作用,动物实验结果表明UDP-葡萄糖 6-脱氢酶(UGDH)、醛酮还原酶1B10(AKR1B10)和SLC7A11在模型大鼠的肝癌细胞中表达更加明显,而通过使用抗纤抑癌方可以显著的抑制这些蛋白在大鼠肝癌细胞中的表达,使大鼠肝癌细胞对铁死亡的敏感性增加,从而对治疗肝癌起到积极作用。王智槟等[34]发现实脾消积方可通过上调肿瘤蛋白53(p53)的表达,下调xCT和GPX4的表达,促进糖代谢异常从而使肝癌细胞铁死亡。α-常春藤皂苷(α-Hederin)是从中药复方肠胃清中分析所得的一种五环三萜类皂苷[35],相关研究发现其在抗肿瘤领域前景广阔。韩松峰等[36]通过测定发现随着α-Hederin使用浓度的增加,肝癌Bel-7402细胞内二价金属转运蛋白1(DMT1)的表达也随之上升,细胞膜对Fe2+的通透性增加,大量的Fe2+被转运运到细胞内,同时ROS水平升高,诱导肝癌细胞铁死亡。周佳林等[37]通过网络药理学发掘半夏-天南星和肝癌的共同靶点,最终筛选出5个与铁死亡相关的靶点,分别为AKT1、RELA、VEGFA、TP53和HIF-1α,且相关研究证明此类靶点与肝癌的发病和治疗相关,说明半夏-天南星可以经相关靶点调控铁死亡,发挥防治肝癌的作用。杨晶[38]通过体外肝癌细胞实验研究固本消积方对人肝癌HepG2细胞铁死亡的作用机制,发现肝癌细胞中TRPV1呈低表达状态,而固本消积方在激活TRPV1后可以抑制GPX4的表达,诱导肝癌细胞铁死亡。

3 小 结

肝癌是各种慢性肝病的终末阶段,如何针对性地诱导肝癌细胞死亡同时保护正常肝细胞的活性,是临床治疗肝癌的一个方向。

铁死亡作为一种新型的细胞死亡机制,其对肝癌的影响是双向的。一方面,铁死亡中Fe2+代谢的紊乱和氧化应激可以促进肝癌细胞死亡,对肝癌起到治疗效果;另一方面,铁死亡也可能加速正常肝细胞的死亡,导致肝癌患者的病情恶化。中药在调节诱导肝癌细胞铁死亡的同时会不会对正常肝细胞造成影响,尚未有学者进一步研究,此后应当重点关注。

现有研究表明,铁死亡的过程与xCT、GPx4、GSH的表达和Fe2+水平密切相关。中药及复方的活性成分以其多途径、多靶点的特点,对于治疗肝癌存在独特的优势,不仅可以直接诱导肝癌细胞铁死亡,还能抑制肝癌细胞对化疗的耐药性,增加其他药物的疗效,中药在通过铁死亡机制防治肝癌的研究领域仍处于探索阶段,其前途一片光明。且现有研究大多局限于动物实验或离体实验,缺乏临床实验验证,相关防治肝癌的靶点及通路的具体机制尚不明确,今后的研究应进一步探索中药调节铁死亡的具体机制,为中医防治肝癌提供新思路。