RNAscope原位杂交技术在肺结核病理诊断中的应用价值

毛 昕,李红娜,吴晨阳,罗 丹,宋旭东

结核病是严重危害公众健康的慢性传染病,中国的发病率较高[1]。肺结核常用的诊断方法是病理检查,典型的组织学改变为坏死性肉芽肿性炎,但坏死性肉芽肿病变并非结核病的特有表现。qRT-PCR法具有较高的敏感度和特异度,但对标本、实验室环境要求苛刻,且易破坏组织的完整性。RNAscope原位杂交技术(简称RNAscope技术)具有较高的敏感性和特异性,可在保留组织形态的基础上原位观察RNA的表达[2]。本文探讨RNAscope技术在肺结核病理诊断中的应用价值,为结核病的诊断提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料收集2018年1月～2022年6月我院病理科肺结核的石蜡包埋标本72例为确诊组,另选取34例非结核性肉芽肿(肺结节病10例、慢性非坏死性肉芽肿性炎24例)为对照组。临床资料显示,患者均无恶性肿瘤、慢性基础性疾病、免疫抑制剂和抗结核治疗等病史。

1.2 qRT-PCR法石蜡包埋组织DNA提取试剂盒、qRT-PCR试剂盒(靶基因为结核分枝杆菌复合群共同插入序列IS6110),均购自北京鑫诺美迪公司,应用ABI 7500 qRT-PCR仪进行核酸扩增。石蜡标本5 μm厚连续切片8张,置于1.5 mL离心管中,操作步骤按试剂盒说明书进行。扩增结果呈S形扩增曲线且Ct值≤40为阳性,Ct值>40或无Ct值为阴性。

1.3 RNAscope技术结核分枝杆菌23S rRNA探针、RNAscope 2.5 HD试剂盒,均购自美国ACD公司。石蜡标本5 μm厚连续切片、烤片,实验步骤严格按试剂盒说明书进行操作。阳性呈棕色细杆状或颗粒状物,易出现在坏死区和坏死周围类上皮细胞中。

1.5 统计学分析采用SPSS 25.0软件进行统计学分析,组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法,以P<0.05为差异有统计学意义。一致性分析采用Kappa值,Kappa值≤0.4两者一致性差,0.40.8一致性很好[3]。

2 结果

2.1 临床特点确诊组中男、女性各36例,中位年龄49岁,其中活检标本42例,手术切除标本30例,均可见坏死性肉芽肿改变(图1)。对照组中男性16例,女性18例,中位年龄50岁,其中活检标本17例,手术切除标本17例。两组标本来源均为肺组织,活检标本与手术标本均无重复。统计学分析显示,两组患者性别、年龄、标本类型,差异均无统计学意义(P均>0.05,表1)。

表1 肺结核与非结核性肉芽肿临床特点

图1 结核性肉芽肿,中心为干酪样坏死,周围见类上皮细胞和多核巨细胞

2.2 RNAscope技术与qRT-PCR法检测效能分析采用qRT-PCR法检测确诊组中结核分枝杆菌DNA插入序列IS6110阳性58例(图2),对照组中阳性2例,其诊断敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度分别为80.56%(58/72)、94.12%(32/34)、96.67%(58/60)、69.57%(32/46)和84.91%(90/106)。对照组中有2例阳性为结节病患者,检测的Ct值分别为39.09、39.54,再次检测Ct值分别为38.97、39.05。RNAscope技术检测确诊组中结核分枝杆菌23S rRNA阳性51例(图3、4),对照组中无阳性病例,其诊断的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度分别为70.83%(51/72)、100%(34/34)、100%(51/51)、61.82%(34/55)和80.19%(85/106)。统计学分析显示,RNAscope技术诊断肺结核的特异度和阴性预测值高于qRT-PCR法,敏感度、阳性预测值和准确度低于qRT-PCR法,两组间差异均无统计学意义(P均>0.05,表2)。

表2 RNAscope技术与qRT-PCR法检测的效能分析

图2 qRT-PCR扩增结果呈S形扩增曲线：Ct值=23.92

图3 RNAscope技术检测显示阳性位于坏死组织内,呈棕色细杆状或颗粒状

2.3 RNAscope技术与qRT-PCR法检测的一致性确诊组中两种方法检测均阳性者49例,qRT-PCR检测阳性而RNAscope技术检测阴性者9例,qRT-PCR检测阴性而RNAscope技术检测阳性者2例。对照组中qRT-PCR检测2例阳性,均为结节病;RNAscope技术检测未见阳性病例。一致性分析显示,qRT-PCR与RNAscope技术检测一致性较好(Kappa值=0.756,表3)。

表3 RNAscope技术与qRT-PCR法检测的一致性比较

3 讨论

结核病是以结核分枝杆菌复合群(mycobacturium tuberculosis complex, MTBC)引起的传染性疾病,肺是其主要靶器官。虽然典型的结核结节或坏死性肉芽肿性炎高度提示结核病,但受感染菌量和自身免疫力的影响,有时较难呈现典型的组织学改变,且其他细菌、真菌感染也可呈肉芽肿、坏死改变。因此,结核杆菌的病原学检测至关重要[4]。结核病的主要病原学检测方法有抗酸染色、结核分枝杆菌培养、基因检测[5],qRT-PCR检测价格低廉、敏感性高,已成为检测结核分枝杆菌应用最广泛的方法[4]。Babafemi等[6]对46项相关研究进行Meta分析,结果显示qRT-PCR检测肺内结核病标本的敏感度为82%,与本实验敏感度(80.56%)相符;特异性(99%)比本实验(94.12%)高,可能与本实验样本量较小有关。Wei等[7]进行Meta分析显示,qRT-PCR对肺内结核分枝杆菌的检测同样具有较高的敏感性(92%)和特异性(96%),并指出高质量的标本和IS6110靶向序列的检测是提高检出率的关键。假阴性可能与样本量不足、标本含菌量少、DNA的降解或PCR抑制剂相关[8]。本实验中有2例结节病患者qRT-PCR检测的Ct值分别为39.09、39.54,经重复检测Ct值分别为38.97、39.05,并见S形扩增曲线判为阳性,但结合患者临床信息,最终仍诊断为肺结节病。国内有文献总结约20%的结节病经结核分枝杆菌DNA的检测可呈阳性,但具体发病机制尚不明确[9]。Zhou等[10]应用RT-PCR对104例结节病标本进行结核分枝杆菌检测,发现20例阳性,但其DNA载量均较低,并提出以1.14×103copies/mL作为结节病与结核病鉴别的定量截断值。Casallas-Rivera等[11]对胸膜结核进行qRT-PCR检测中,在间皮瘤、间皮增生标本中阳性。因此,如qRT-PCR结果与临床诊断截然相反时,不能仅采取qRT-PCR检测作为最终诊断,还需结合其他靶点或方法检测。

RNAscope是一种新颖的RNA原位杂交技术,利用独特的探针设计和杂交的信号放大系统,在单个细胞中实现单分子的原位可视化,不仅弥补传统PCR法对组织的破坏,而且也避免非目的基因感染。RNAscope探针是结核分枝杆菌较为独特的碱基序23S rRNA,与其他相似分枝杆菌碱基序列存在差异,为检测和鉴定提供较好的目标[12]。本实验显示RNAscope技术对肺结核分枝杆菌检测的特异度为100%和敏感度为70.83%,与qRT-PCR法相比,其特异度、阳性预测值较高,敏感度、阴性预测值和准确度略低,但两种检测差异均无统计学意义。Rodriguez等[13]应用RNAscope技术检测人体结核病石蜡包埋组织同样具有较高敏感性,并可特异性的区分非结核分枝杆菌。Robertson等[14]报道RNAscope技术检测结核分枝杆菌RNA敏感性较高,并利用双探针定量分析显示干酪样坏死区核酸复制速度比周围组织减慢。有文献报道RNAscope技术敏感性低于qRT-RCR,原因可能有以下几个方面:(1)菌量极少,部分活检组织可能在qRT-PCR切片检测后再行RNAscope技术检测,所剩组织小、含菌量少。(2)患者病情处于隐匿期或静止期,结核分枝杆菌为自我保护将23S rRNA裂解,逃避机体免疫,难以被检测[15]。(3)设计探针不同,IS6110为多拷贝基因,23S rRNA为单拷贝基因,通常单拷贝基因检测靶标敏感性低于多拷贝基因检测靶标。因此,RNAscope检测石蜡包埋组织中的结核分枝杆菌具有较高的敏感性和特异性,有助于原位观察组织病理形态,协助肉芽肿性病变的诊断与鉴别诊断。

本组采用RNAscope检测72例肺结核病石蜡标本有51例阳性,阳性信号多集中于坏死或与类上皮细胞交界处,结核分枝杆菌易出现在坏死区域或与其相邻的类上皮细胞中,与文献报道一致[16],提示在进行分子检测时应选择典型结核结节或坏死性肉芽肿区域较多的蜡块。研究显示,结核分枝杆菌RNA的含量随细菌活性减低或死亡而减少[17]。因此,RNAscope技术切片阳性信号的密度可能在某种程度反映患者体内结核分枝杆菌的活性状态,有助于患者的诊断和治疗。虽然结核分枝杆菌DNA分子检测对结核病的定性较为实用,但是在区分死菌和活菌时效果较差,甚至体内残存溶解或受损的DNA片段仍可进行检测[16],提示Ct值的大小不能直接代表患者体内结核分枝杆菌的活性状态。RNAscope检测比qRT-PCR更加直观,在不破坏组织完整性的同时,低倍视野即可获得明确阳性信号,也便于资料存档。

目前结核耐药仍是影响结核病预后的主要因素,虽然本组未进行结核耐药的相关检测,但有文献报道耐药、药物治疗相关机制与23S rRNA基因密切相关。RNAscope技术可在同一张切片进行多基因检测[2],其在结核分枝杆菌、耐药相关检测中有较好的应用价值。本实验为国内首次应用RNAscope技术对结核分枝杆菌23S rRNA进行检测,结果显示敏感度、特异度较高,其在临床应用的前景较好。