疱疹病毒利用宿主蛋白高效复制机理及其抑制剂研究进展

田文骏,游婧铃,王晓佳

(中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193)

疱疹病毒科病毒感染每年在全世界造成严重的人类和动物发病及死亡。疱疹病毒科病毒以单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)为代表,HSV是一种有包膜的双链DNA病毒,基因组全长约152 kb,编码80多个开放阅读框。HSV感染会引起多种疾病,包括口腔疱疹、结膜炎、生殖道炎症和不同程度的疱疹性脑炎[1]。在动物临床中,猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)是对经济动物威胁最大的疱疹病毒科病毒,其感染猪主要引起仔猪脑炎和母猪生殖障碍[2],根据近几年的临床报道,PRV可以突破种间屏障向人类社会传播[3]。目前,只有少数药物被批准用于治疗单纯疱疹病毒感染,如阿昔洛韦(Aciclovir,ACV),ACV在体内代谢为阿昔洛韦-三磷酸后,可与疱疹病毒DNA聚合酶结合从而终止病毒复制[4]。近年来,HSV突变引起的耐药性对病毒感染的治疗仍然是一个重要的挑战[5]。为解决HSV的耐药问题,研究人员运用一系列蛋白质组学策略,如高通量筛选体系、蛋白质芯片和免疫共沉淀等技术,鉴定病毒感染前后结构和功能发生显著变化的细胞蛋白,这些细胞蛋白参与重要的细胞活动,表明其在病毒复制周期中发挥着重要作用。以此为依据开发的靶向宿主的抗病毒药物(Host-targeting antivirals,HTAs),可以减少病毒耐药性的发生[6]。HTAs可以通过同时靶向病毒蛋白和细胞蛋白的双抑制策略,进一步降低由于病毒变异产生的耐药问题[7]。本文综述了病毒劫持或干扰上述细胞蛋白的研究进展,及相应靶点的抗病毒药物的研究进展,为深入了解病毒和宿主细胞的相互作用关系、发现病毒作用靶位以推广临床可用的新型抗病毒制剂提供参考。如图1所示,疱疹病毒进入细胞后,病毒蛋白可以操纵或劫持细胞蛋白,从而阻断细胞活动(如抑制细胞自噬、抑制先天免疫、沉默细胞基因转录和劫持细胞蛋白翻译),并促进自身复制。如图2所示,1～7和a～g阶段分别表示HSV和PRV从入侵细胞到释放出胞过程中病毒蛋白对细胞活动的影响,1～7阶段中HSV对细胞活动影响的机制如表1所述。

表1 疱疹病毒蛋白在不同阶段对细胞活性的影响

图1 疱疹病毒操纵细胞蛋白示意图

1 细胞凋亡和自噬体系

细胞凋亡(Apoptosis)和自噬(Autophagy)是主要的程序性细胞死亡形式,同时可作为宿主在细胞水平抵御病毒感染的一种机制,通过直接干扰病毒的复制或清除受感染细胞,从而限制病毒的复制和扩散。然而,这种自我牺牲方式往往无法一直进展下去,病毒在与宿主相互斗争的过程中,建立了一套操纵细胞活动的程序和对策,比如,病毒能够通过抑制或延缓受感染细胞过早死亡,建立持续性感染[14];还可通过促进细胞程序性死亡,干扰病毒抗原提呈,或杀死未感染的免疫细胞。

1.1 病毒诱导的细胞凋亡过程 细胞凋亡可通过内源性和外源性两条途径进行,内源性途径被认为保守存在于多细胞动物中,而外源性途径则被认为是脊椎动物所特有的。其中,外源性凋亡途径对于先天免疫和适应性免疫的调控十分重要,例如,病毒感染树突状细胞或自然杀伤细胞后,会使这些细胞快速产生抗病毒免疫反应,上调凋亡相关因子配体(Factor related suicide ligand,FasL)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNFα)和TNF相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL),诱导感染细胞发生凋亡[15]。PRV感染可诱导猪体内细胞凋亡,病毒感染后激活细胞氧化应激引起自由基增加,并以剂量和时间依赖性方式诱导促凋亡蛋白B细胞淋巴瘤(B-cell lymphoma,Bcl)家族蛋白的表达,特异性DNA损伤传感器和组蛋白H2AX磷酸化的表达也显著增加,进而激活检查点激酶1/2和抑癌基因p53的表达,诱导细胞凋亡[16]。咖啡因是一种已知的DNA损伤抑制剂,被发现可以抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的激活,阻止PRV诱导的细胞凋亡;此外,抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸被证明可以防止细胞活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的产生,保护DNA不被切割,从而阻止病毒诱导的细胞凋亡[17]。

内源性凋亡途径中,Bcl-2家族蛋白,包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白,可调控线粒体结构和功能的稳定性,发挥凋亡“主开关”的作用。很多病毒蛋白,例如,疱疹病毒中爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus,EBV)BamHI H片段右可读框1(BamHI H rightward reading frame 1,BHRF1)编码的早期基因和卡波西肉瘤疱疹病毒Bcl-2蛋白以及腺病毒的E1B-19K蛋白都具有Bcl-2活性,可通过抑制细胞凋亡过程,促进自身复制。单纯疱疹病毒-1(Herpes simplex virus 1,HSV-1)病毒蛋白激酶US3,可通过诱导促凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2基因相关启动子(Bcl-2 associated death promoter,Bad)发生磷酸化,阻止凋亡发生[12]。研究还发现,许多病毒感染细胞后均可激活磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinases,PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB)(PI3K/PKB)通路,进而通过诱导细胞增殖分化避免细胞凋亡,从而促进自身复制[18]。如图2中过程6所示,HSV-1在复制早期可受到凋亡影响,直到病毒表达了与PKB功能相近的US3蛋白,抑制了细胞凋亡的进程[19]。

1.2 病毒诱导的细胞自噬过程 Bcl-2家族蛋白通过相互作用调控细胞自噬,这些功能也被病毒利用,通过病毒蛋白对自噬过程进行调控,促进自身复制。例如,HSV-1的毒力蛋白感染细胞蛋白 34.5(Infected cell protein 34.5,ICP34.5)可与自噬相关蛋白Beclin-1结合(图1),直接阻止自噬溶酶体的形成[13]。黄芩苷(Baicalin)等自噬抑制剂可通过减弱自噬相关蛋白(Autophagy-related protein,Atg)5-Atg12形成复合体并调控微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated protein 1 slight chain 3,LC3)功能,抑制流感病毒复制[20]。

据报道,HSV-1急性感染后,感觉神经元附近抗原阴性的神经元含有类似自噬体和自溶酶体积累的结构,最终形成LC3簇,这种积累抑制了细胞自噬,此外,HSV-1感染会下调初级神经元中自噬关键蛋白液泡分选相关蛋白4(Vacuolar protein sorting-associated protein 4,Vps4)的转录和翻译,同时激活信号转导与转录激活因子1(Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)和LC3[21]。由此可见,HSV-1可以通过多种途径调节细胞自噬从而促进自身复制,为寻找病毒抑制剂提供潜在靶点。

2 泛素-蛋白酶体系

泛素化修饰与蛋白质降解和功能调控密切相关。泛素化修饰涉及活化酶E1、结合酶E2和连接酶E3的一系列反应。近年来越来越多的证据表明,病毒以多种方式作用于泛素-蛋白酶体系,例如,有些病毒需要利用该体系完成入侵、复制、装配和出芽过程;有些病毒编码泛素模拟蛋白以干扰或降解对病毒复制不利的细胞蛋白;还有些病毒可利用该体系扭转或降解宿主免疫系统[22]。

据报道,HSV-1入侵阶段,多功能蛋白感染细胞蛋白0(Infected cell protein 0,ICP0)可利用泛素-蛋白酶体系,在病毒穿透细胞过程中发挥重要作用[8]。HSV-1的ICP0含有环指(RING)结构域,因此具有泛素连接酶的功能,ICP0可泛素化修饰转录抑制因子早幼粒细胞白血病蛋白(Promyelocytic leukemia protein,PML)和DNA损伤反应蛋白环指蛋白8/168(RING finger protein 8/168,RNF8/RNF168),以促进病毒基因转录,增强病毒复制[23](图1和图2)。作为细胞周期重要转录因子,p53是一种不稳定蛋白,受到应激性刺激后变稳定,导致细胞生长阻滞或凋亡,因此,p53是多种病毒复制的共同障碍。疱疹病毒可通过泛素-蛋白酶体系将p53灭活或降解,从而阻止凋亡发生[24]。疱疹病毒去泛素化酶在病毒感染中越来越重要,EBV编码的大被膜蛋白BPLF1具有去泛素化酶活性,可以调节病毒DNA复制和修复。Atkins等通过分子筛选确定了BPLF1的抑制剂,即苏拉明(Suramin),降低了约90%的病毒传染性,对细胞活力没有明显的影响,为EBV感染的特异性治疗提供了一种新的途径[9]。此外,卡波西肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)的K3/K5蛋白具有E3酶活性,可泛素化主要组织相容性复合体-I(Major histocompatibility complex-I,MHC-I),使其从细胞表面降解,以干扰其抗原提呈功能。

3 核-质转运体系

核质转运为真核细胞的基本生命活动之一,其通过一套有效的分子机制来调控细胞内生物大分子在细胞核-质间有效的转运,从而维持细胞整体活动的正常运转。核孔复合体(Nuclear pore complex,NPC)是细胞核内外物质交换的主要通道,蛋白在胞浆内合成后通过NPC进入胞核,这个过程除了需要核孔蛋白、胞浆内核转运受体和三磷酸鸟苷酶(Guanosine triphosphatase,GTPase)等蛋白参与外,蛋白的结构特征亦发挥重要作用：一方面,不同蛋白拥有各自特殊的核定位信号(Nuclear localization signal,NLS),可被核输入蛋白(如Importin-α/β)所识别,进而引导蛋白主动转运进入细胞核;另一方面,蛋白输出细胞核,则要通过核输出信号(Nuclear export signal,NES)和核输出受体(如CRM1)的介导(图2)。

在病毒感染过程中,病毒和细胞蛋白在细胞核质之间穿梭的现象非常普遍,一些病毒在宿主细胞中复制时需要将自身的遗传物质、病毒复制相关蛋白和部分结构蛋白输入宿主细胞核内,大部分病毒蛋白利用宿主的核-质转运机制完成自身的运输过程。本课题组发现,多功能病毒蛋白ICP34.5在多个水平上干扰或破坏几种细胞途径,包括利用核仁蛋白53(Nucleolar protein 53,NOP53)出核,促进真核起始因子2α(Eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)去磷酸化,从而有利于病毒复制(图1),NOP53基因敲除后,显著减轻了HSV-1感染小鼠的组织损伤和炎症反应,降低了病毒载量[10]。

3.1 病毒蛋白核-质转运 HSV-1的感染细胞蛋白27(Infected cell protein 27,ICP27)借助于核通道蛋白62 kDa(Nucleoporin 62 kDa,Nup62),将病毒mRNA输出细胞核,以进行病毒蛋白合成[11](图2)。HSV-1的长独特区编码蛋白(Unique long region protein,pUL)36和pUL25,可在核孔蛋白核通道蛋白214 kDa(Nucleoporin 214 kDa,Nup214)和核通道蛋白358 kDa(Nucleoporin 358 kDa,Nup358)共同识别下,促使病毒基因输入细胞核[25]。有研究表明,在神经元中,Importin α1是HSV-1 ICP4蛋白入核和核衣壳组装的关键蛋白[26]。如上所述,病毒组分的出入核是病毒复制的关键一环,随着对HSV-1复制机制的研究,会发现越来越多潜在的药物靶点,为临床治疗HSV-1感染提供依据。

HSV-1病毒核糖核蛋白(Viral ribonucleoprotein,vRNP)复合体的形成,由病毒RNA、RNA聚合酶和核蛋白组成。来普霉素 B(Leptomycin B,LMB)作为CRM1的特异性抑制因子,可通过阻止vRNP从细胞核向细胞质的输出,抑制DNA病毒的复制。尽管LMB具有一定的抗病毒效果,但在动物试验中观察到较为明显的毒性[11],因此,需要对其进行进一步的研究和改进,以提高其在控制病毒感染中的治疗价值。作为CRM1的同源体,核输出蛋白1(Exportin 1,XPO1)介导富含亮氨酸的核输出信号依赖的细胞蛋白的转运过程,以进行细胞正常生命活动。KPT-335(亦称Verdinexor)是XPO1的小分子拮抗剂,体内研究表明,KPT-335可以减少肺内病毒颗粒和细胞炎性因子的产生,并且没有观察到明显的毒性,因此,KPT-335具有潜在的应用前景[27]。

3.2 病毒蛋白细胞质运输 疱疹病毒基因表达、DNA复制、衣壳组装和基因组包装都发生在细胞核中,成熟的核衣壳在核膜内包装,然后脱包膜进入细胞质。核衣壳一旦进入细胞质,就会沿着微管到达细胞器,随后产生成熟的感染性病毒颗粒,后者被分类到感觉神经元末端或上皮细胞连接处,再传播到未感染细胞。HSV-1出芽前利用细胞器膜构建其囊膜,出芽后向未感染细胞传播[28]。白藜罗醇(Diphyllin)是一种从热带植物中提取的化合物,目前研究认为其可以作为囊泡H+-ATP酶的有效抑制剂[29]。包括疱疹病毒和黄病毒科的寨卡病毒在内的多种囊膜病毒,会通过受体介导的内吞作用进入宿主细胞,引起内体酸化,从而成功建立入侵过程,因此,白藜罗醇也可作为部分囊膜病毒的广谱抑制剂。小分子6-脱氧葡萄糖-白藜罗醇 (6-deoxyglucose-diphyllin,DGP)可防止靶细胞内体/溶酶体酸化,从而抑制寨卡病毒和细胞膜的融合[30]。

4 生物合成体系

病毒复制需要挟持宿主细胞的蛋白翻译系统,在真核细胞中,蛋白质翻译过程包括3个步骤：起始、延伸和终止。真核生物的翻译起始涉及真核起始因子家族(Eukaryotic initiation factors,eIFs)。由eIF4A、eIF4E和eIF4G组成的eIF4F吸收小核糖体亚基,并与mRNA 5′端m7GTP残基结合,进行帽依赖翻译。许多病毒利用宿主eIFs启动病毒蛋白翻译,因此,elFs及其磷酸化是潜在的抗病毒药物靶点。

丝裂原激活的蛋白激酶作用激酶(Mitogen activated protein kinase interacting kinase,MNK)对eIF4E第209位丝氨酸的磷酸化修饰是肿瘤增殖所必需的,此外,其磷酸化修饰与促进一些病毒蛋白的翻译和复制有关,包括疱疹病毒[31]。因此,针对p-eIF4E的抑制剂具有用于抗癌和抗病毒治疗的潜在可能性。本课题组发现,RAF265可以降低p-eIF4E的水平,以抑制HSV-1病毒蛋白的合成,在小鼠试验中,小鼠按10 mg/(kg·d)剂量口服RAF265,连续3 d,可降低小鼠大脑中30%的病毒载量,并可以减轻感染小鼠体内的炎症反应[32]。RAF265以前被用于治疗黑色素瘤和其他鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌性同源体B1(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,B-Raf)编码蛋白的第600位密码子对应的缬氨酸被谷氨酸替代(V600E),即B-Raf V600E突变的癌症,并且有报道表明,RAF265的细胞毒性显著低于索拉非尼和其他抗癌药物[29]。RAF265的活性为将这种抗肿瘤药物转化为抗病毒药物提供了应用前景。本课题组还发现,生物碱高三尖杉酯碱(Homoharringtonine,HHT)可通过抑制eIF4E的磷酸化,减少病毒 mRNA 的翻译,从而抑制包括 HSV-1 在内的多种病毒复制[33]。因此,靶向细胞翻译及其信号通路的药物有望用于广谱抗病毒药物的开发。

5 先天免疫反应

宿主先天免疫系统能够通过细胞因子将免疫细胞招募到病原体感染部位,并激活适应性免疫系统,这对于控制致病性感染至关重要。病毒感染会激活干扰素调节因子3/7(Interferon regulatory factor 3/7,IRF3/IRF7)和核转录因子-κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB),介导干扰素(Interferon,IFN)和炎性因子的表达,启动先天免疫反应。IFN由病毒感染的细胞产生,与细胞表面IFN受体结合,诱导数百种IFN刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)产物上调。干扰素和炎性因子在调节先天免疫反应以控制病毒感染中发挥重要作用。

5.1 病毒蛋白对抗感染时的宿主防御反应 病毒一方面利用宿主细胞完成自身复制,另一方面还需逃避细胞免疫反应以优化复制过程。为了确保有效复制,HSV-1编码几种病毒蛋白以对抗感染时的宿主防御反应,HSV-1 ICP0在病毒感染早期,可劫持人类免疫系统的感应器蛋白——干扰素诱导蛋白16(Interferon-inducible protein 16,IFI16),使后者迁移至细胞质,最终困在病毒粒子中[34]。ICP0还可与NF-κB结合,以抑制TNF-α介导的NF-κB信号激活[35]。水痘-带状疱疹病毒(Varicella zoster virus,VZV)的ORF61蛋白可通过泛素化降解IRF3,抑制细胞先天免疫[36]。对这些机理的了解有助于进一步认识疱疹病毒如何进行免疫逃避,从而寻找合适的药物以防治宿主免疫功能被病毒破坏。

5.2 病毒逆转或干扰宿主免疫系统 病毒感染可诱导体内炎症,NF-κB在炎症和病毒感染相关基因的调控中发挥着重要作用,疱疹病毒能够通过激活NF-κB通路促进自身复制。蛋白酶体抑制剂硼替佐米(PS-341/bortezomib)是一种抗癌药物,可阻断NF-κB激活,研究结果表明,PS-341可降低多种疱疹病毒的入侵和复制[37]。

越来越多的报道表明,病毒可利用泛素-蛋白酶体系调节宿主免疫反应,也可模拟泛素连接酶功能靶向泛素化修饰并降解细胞的抗病毒蛋白,这也是病毒进行免疫逃避的主要手段之一。杨梅素(Myricetin)是一种多羟基黄酮化合物,是各种人类食物的主要成分之一,也被称为膳食类黄酮。Myricetin通过直接灭活病毒、激活宿主抗病毒防御、激活NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路以及细胞因子基因的表达激活宿主抗病毒防御,从而抑制PRV感染[38]。最近在调节宿主免疫反应方面,抗病毒药物的发展大大促进了病毒学和药剂学领域的发展,并对人类和动物的卫生保健做出了重大贡献。

6 展望

自2013年以来,只有12种药物被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准用于病毒感染的治疗;其中只有1种用于疱疹病毒中巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)的治疗,10种用于丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒感染的治疗,1种用于流感病毒的治疗。现有药物在控制其他病毒感染方面的局限性和使用抗病毒药物新出现的耐药性表明,迫切需要有效的药物用于病毒感染的治疗。疱疹病毒是严重威胁公共卫生的重要病原,特别是在免疫力较低的人群中。虽然抗病毒治疗的需求迅速增长,抗病毒药物的审批却非常缓慢。开发一种新药可能需要15年左右的时间,花费数十亿美元,高昂的研发成本是抗病毒药物发展缓慢的重要原因。从数百种化合物中鉴定出有应用价值的临床前药物中,大约有10%可能被批准临床使用,大约30%的新药在临床试验中未能通过安全协议。体外研究可以确定目标病毒株,确定易受病毒感染的宿主细胞范围,并揭示专门用于控制病毒感染的额外分子靶点。宿主分子靶标的价值可以通过RNA干扰或CRISPR/Cas9等方法基因敲除或突变后进行评估。体内研究可确定最大耐受剂量和副作用、控制病毒感染的功效和血浆中药物浓度的药代动力学,以便重新建立治疗病毒疾病有效和安全的方案。

老药新用是将已经获得FDA批准的药物用于开发治疗病毒感染的药物,由于这些药物基本经历了I期和/或II期临床试验,并且已经建立了毒性特性,因此将其重新用于抗病毒治疗可能为开发抗病毒药物提供一种高效、经济和安全的方法。当然,为了重新利用药物,如抗癌药物和其他药物,研究人员仍然需要通过体外、体内和临床研究,以确定一种候选药物治疗病毒疾病的价值。一般来说,病毒感染是一种急性发病过程,对于病毒感染的用药剂量可能需要比治疗最初靶向慢性疾病时的使用剂量更高,才能有效抑制急性感染,因此,需要仔细确定改用药物的给药途径和毒性。病毒感染不仅会改变宿主的免疫系统,还会改变宿主器官的功能,从而干扰药物的药理作用或引起额外的副作用。因此,研究能够靶向病毒成分、调节细胞机制和减轻不良反应的联合疗法,以达到提高抗病毒疗效、降低病毒耐药性、最小化毒性和副作用的最佳结果。研究与病毒侵染相关的细胞蛋白,是发现并确定抗病毒制剂新靶点的有效策略。

近十几年以来,科学家们鉴定了一些涉及生物学现象多个方面的细胞蛋白,在病毒-宿主相互作用过程中的特性、细胞定位、结构和功能均发生显著变化。在深入了解病毒劫持或干扰宿主细胞蛋白的基础上,靶向设计抗病毒策略,有望促进宿主细胞在与病毒对抗中占据优势地位。