玉溪霍尔多巴吉鹅感染贝氏隐孢子虫的分子鉴定

陈俊蓉,谢昕言,贺君君,杨建发,王 萍

(1.云南农业大学动物医学院,云南 昆明 650201 ; 2. 玉溪农业职业技术学院动物科技学院,云南 玉溪 653100)

贝氏隐孢子虫(Cryptosporidiumbaileyi,C.baileyi)隶属隐孢子虫科(Cryptosporidiidae)、隐孢子虫属(Cryptosporidium),宿主范围广,可感染30多种禽类,可导致感染禽类的生产性能下降甚至死亡,是潜在的人兽共患原虫病病原之一[1-2]。贝氏隐孢子虫通过呼吸道途径传播,主要寄生于气管和法氏囊的丛毛中,可导致禽类产生呼吸困难、气喘和咳嗽等症状[3-5]。作为贝氏隐孢子虫宿主之一的霍尔多巴吉鹅,为从欧洲引进培育的绒蛋兼用型优良地方鹅品种,具有个体大、体质健壮、抗病力强、产绒率高、羽绒品质好等优势,在肉质、羽绒、产蛋性能等方面都给养殖户带来巨大的经济收入,因此被广泛饲养[6-7]。值得注意的是,我国有关霍尔多巴吉鹅病原的报道主要集中于细菌病和病毒病,例如多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、小鹅瘟病毒和新城疫病毒感染[8-10],有关于云南省养殖的霍尔多巴吉鹅感染寄生虫的报道较为罕见。

Feng等[11]在研究中提出核糖体小亚基RNA(Small subunit ribosomal RNA,SSU rRNA)基因普遍存在于真核和原核生物中,且其内部多态区位点具有重复拷贝序列、半保守区和高变异区,为研究隐孢子虫不同种属间的亲缘关系提供了重要信息。因此,该基因常被用于隐孢子虫的虫种鉴定和基因型研究,辅助构建系统的微孢子虫分类体系[12]。

本试验通过基于隐孢子虫SSU rRNA位点的分子生物学鉴定方法对云南省玉溪市某霍尔多巴吉鹅养殖场获取的粪便样品进行检测,发现隐孢子虫检测率为20.45% (9/44),经过分子鉴定发现该隐孢子虫为贝氏隐孢子虫,该结果为鹅隐孢子虫的宿主研究提供参考,为进一步科学防治霍尔多巴吉鹅隐孢子虫病提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源 从云南省玉溪市某霍尔多巴吉鹅养殖场随机采取不同日龄鹅的粪便样品,逐一用自封袋分装,分别记录日龄并编号(表1),置于4 ℃条件下保存。

表1 采集样品的组成

1.2 主要试剂 粪便DNA提取试剂盒,购自天根生化科技(北京)有限公司;GelStain核酸染料,购自上海丰科生物科技股份有限公司;2×AccurateTaq预混液(含染料),购自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.3 主要仪器 生物显微镜(B302),重庆奥特光学仪器有限责任公司产品;PCR仪 (PTC-1148),英国比比科技有限公司产品;凝胶成像系统(WGD-30),大韩科学仪器有限公司产品;低速离心机(AS-6KS-1638),杭州奥盛仪器有限公司产品。

1.4 试验方法

1.4.1 饱和盐水漂浮法 用玻璃棒将粪便样品与ddH2O充分混匀过200目筛,除去较大的粪渣。用50 mL离心管收集滤液,滤液经1 500 r/min离心10 min,弃上清。沉淀加入10 mL饱和盐水涡旋混匀,500 r/min离心10 min,取上清,用蒸馏水稀释30倍后1 500 r/min离心10 min,弃上清。沉淀用0.01 mol/L PBS洗涤2次,悬浮于PBS中,置于油镜下观察并记录。

1.4.2 分子生物学鉴定方法

1.4.2.1 DNA提取 取不同日龄的鹅粪便样品,按照粪便DNA提取试剂盒说明书操作提取DNA,将提取的DNA置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.4.2.2 巢式PCR扩增 参考Xiao等[12]基于隐孢子虫SSU rRNA基因的巢氏PCR方法设计上、下游引物(表2),送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 巢氏 PCR 引物序列

第1轮PCR模板为1.4.2.1中所提取的DNA样品,第2轮PCR模板为第1轮 PCR产物。PCR扩增体系为 25.0 μL：2×AccurateTaq预混液(含染料)12.5 μL,ddH2O 8.5 μL,DNA模板2.0 μL,上、下游引物各1.0 μL。第1轮PCR扩增程序：94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,重复35次;最后72 ℃ 10 min;16 ℃保温。第2轮PCR扩增程序：94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,58 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,重复35次;72 ℃ 10 min;16 ℃保温。在巢氏PCR检测过程中同时设置阴性对照。

1.4.2.3 SSU rRNA 基因序列测定和分析 将阳性PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序并拼接,于NCBI进行Blast在线比对分析。以芽囊原虫(Blastocystissp.)作为外群,利用MEGA 6.0软件以邻接法构建系统发育进化树,Bootstrap设置为1 000次。用DNASTAR软件MegAlign程序进行序列同源性分析。

2 结果

2.1 改良饱和盐水漂浮法镜检 在光学显微镜的油镜下观察,可见到无色、外表呈光滑的卵圆形卵囊,测量大小为6.14 μm×5.22 μm,参照我国的卫生行业标准(图1)[13],初步判定为隐孢子虫卵囊(Cryptosporidiumsp.)。44份鹅粪便样品中,共9份检出隐孢子虫卵囊,其中5日龄样品1份、36日龄样品8份。

图1 隐孢子虫卵囊模式图[13]

2.2 巢式PCR扩增 巢式PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示,可得到与预期片段大小(830 bp)相符的电泳条带,即为隐孢子虫阳性。44份DNA样品中,共有9份DNA样品检测出目的条带,其中5日龄样品1份、36日龄样品8份。部分PCR产物电泳结果见图2。

图2 隐孢子虫 SSU rRNA 基因的巢式 PCR 扩增

2.3 SSU rRNA 基因序列测定和分析 经测序可知,PCR扩增获得基因序列片段长度为830 bp;经序列比对可知,9份阳性样品与贝氏隐孢子虫(C.baileyi)相似度均高于99.76%,序列中A、T、C和G的平均含量分别为31.87%、29.11%、17.06%和21.96%,(A+T)的含量(60.98%)远高于(G+C)的含量(39.02%)。随机选取1份5日龄样品和1份17日龄样品的DNA序列,分别命名为CB1和CB2,使用 MEGA 6.0构建系统发育进化树,结果显示,本试验获得的隐孢子虫阳性分离株以100.0%的置信度与NCBI中的贝氏隐孢子虫序列汇聚于同一支(图3)。

3 讨论

贝氏隐孢子虫感染可造成禽类严重的呼吸道和消化道损伤[2]。蒋金书等[3]对鹅进行了贝氏隐孢子虫的人工感染试验,发现7、10和17日龄的鹅均有死亡。禽类中隐孢子虫主要流行种类为禽隐孢子虫(C.avium)、贝氏隐孢子虫(C.baileyi)、火鸡隐孢子虫(C.meleagridis)和鸡隐孢子虫(C.galli)[14-15]。贝氏隐孢子虫协同其他病原共同感染宿主会损伤宿主的免疫功能,从而导致后续的疫苗接种抗体滴度下降乃至免疫失败[16-18]。霍尔多巴吉鹅作为被普遍养殖的经济家禽,在肉质、羽绒和产蛋性能等方面都给养殖户带来巨大的经济收入。本试验在霍尔多巴吉鹅粪便样品中检测到的贝氏隐孢子虫具有传播风险,且具有潜在的人兽共患的特性[19],给养殖户带来巨大的经济损失的同时,也存在潜在的公共卫生风险,及时防治非常重要。

有关云南省禽类感染隐孢子虫的报道较少。云南省作为人感染隐孢子虫较多的省份,针对不同宿主进行防范至关重要[20]。高庚渠[21]提出,贝氏隐孢子虫主要感染禽类,不同地域源、不同宿主源的贝氏隐孢子虫感染同一种禽类时,其致病性存在差异,鸭源贝氏隐孢子虫分离株的致病性较鸡源、鹌鹑源、鸵鸟源和宠物鸟源强。但研究者未提及鹅源贝氏隐孢子虫的致病性,仍有待研究。史美清等[22]曾对广州地区的禽类隐孢子虫感染情况开展调查,结果发现,鹅的贝氏隐孢子虫阳性率达12.43%(71/571);另外,安徽省也曾有鹅类感染贝氏隐孢子虫的报道,阳性率达1.34%(8/594)[23],但二者均未阐明宿主鹅的种类。本试验发现玉溪市某霍尔多巴吉鹅养殖场饲养的霍尔多巴吉鹅被贝氏隐孢子虫感染,表明该养殖场存在贝氏隐孢子虫的感染,提示该养殖场需要加强防虫管理。

畜禽粪便中含有大量的隐孢子虫卵囊,经雨水冲刷可污染水体和食物等,以致隐孢子虫病多暴发于夏秋季节[24]。Hofstra等[25]研究发现,全球每年会产生约3×1017个隐孢子虫卵囊污染地表水。夏秋季节应重视对该寄生虫的防控,隐性感染个体和被污染水源可能成为传播源头。及时处理家禽产生的粪污、采取全进全出的家禽养殖模式,将有助于阻断隐孢子虫的传播。利用家禽粪便涂片进行Ziehl-Neelsen抗酸染色可对隐孢子虫进行初步诊断,进一步具体到种的鉴定可参照国家标准[26]。由于隐孢子虫属的卵囊对不良的自然环境具有较高的耐受能力,且对绝大多数消毒剂和防腐剂具有较强的抵抗力,因此养殖场中需常备对隐孢子虫卵囊有效的消毒剂,如过氧化氢和氨水等。此外,臭氧有望成为对卵囊灭活的重要化学消毒剂。