禽呼肠孤病毒在我国部分地区蛋鸡群中的血清流行率和风险因素分析

郑 好,杨 霞,张 素,赵一萌,汤君宇,高 丽,曹 红,马国明,王占新,郑世军,王永强

(1. 中国农业大学动物医学院 兽医公共卫生安全全国重点实验室 农业农村部动物流行病学重点实验室 ,北京 海淀 100193 ; 2. 北农大科技股份有限公司,北京 海淀 100193 ; 3. 温氏食品集团股份有限公司广东省畜禽健康养殖与环境控制企业重点实验室,广东 云浮 527300)

禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属,呈球形的正二十面体结构,具有双层衣壳,衣壳外无囊膜包被。该病毒于1954年由 Fahey和 Crawley[1]首次从病鸡呼吸道内分离得到,于1972年首次被确定为鸡病毒性关节炎的致病因子[2],1985年王锡堃等[3]证实我国存在ARV感染。ARV基因组为线性双股 RNA,可分为10个基因节段,按照其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率由大到小依次可分为L组(包含L1、L2和L3三个基因片段)、M组(包含M1、M2和M3三个基因片段)、S组(包含S1、S2、S3和S4四个基因片段)。这些基因片段至少编码8种结构蛋白(λA、λB、λC、μA、μB、σA、σB和 σC蛋白)和4种非结构蛋白(μNS、σNS、p10和p17蛋白)[4]。其中,σC蛋白位于病毒外层衣壳,是ARV表达的所有蛋白中唯一具有吸附宿主细胞能力的蛋白,在病毒侵染细胞时可协助病毒吸附到宿主细胞表面;此外,σC蛋白还是ARV的主要抗原,其C-末端具有特异性的中和抗原表位,可刺激宿主分泌特异性中和抗体,因此,σC蛋白是开发抗ARV亚单位疫苗的研究热点,该蛋白可通过大肠杆菌等原核生物或鸡胚成纤维细胞等真核系统进行表达,且表达产物具有良好的免疫原性,因此,σC蛋白也可被用于建立ARV的临床诊断方法,如酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测方法的建立[5]。

ARV主要有3种致病表现,一是影响宿主的胃肠道功能,主要表现为消化吸收不良、腹泻、精神萎靡和羽毛杂乱等;二是导致宿主发生关节疾病,主要表现为关节炎、腿部肿胀和跛行等;三是同时表现胃肠道和关节症状。该病毒在感染家禽后还可破坏宿主的免疫系统,增加宿主对其他病原微生物的易感性,导致家禽死淘率升高、饲料转化率降低和产蛋量下降,此外,该病毒引起的关节疾病使禽类屠宰废弃率升高,给我国养禽业造成了较大的经济损失[4]。

ARV在世界范围内普遍存在,摩洛哥、埃及和莫桑比克南部等地的肉鸡群中ARV感染率均在80%以上[6-8]。该病毒宿主广泛,可感染包括鸡、火鸡和鸭在内的多种禽类,传播途径包括水平传播和垂直传播,临床中以水平传播为主,ARV在物品表面、饲料和饮用水中都能存活一定时间,粪便是主要的传播媒介[9-10]。ARV在我国流行范围较广,感染率呈上升趋势,近年来的研究表明,该病毒在我国的流行过程中毒力不断增强,毒株基因型日趋复杂且存在变异株,在吉林省、山东省和安徽省等地分别在病鸡体内分离得到了ARV变异株ARV-JL21-0102、ARV-SD20-3203、AHZJ19和PHC-2020-0545,其中AHZJ19与当前的疫苗株S1133的 σC蛋白仅有50%左右的同源性[11-15],提示目前临床使用的传统疫苗可能无法提供完全的免疫保护作用。目前,我国并没有治疗禽类感染ARV的有效药物,因此做好预防工作是降低ARV感染率、减少病鸡死淘率的重要措施。本试验从我国9个不同省市采集蛋鸡血清样本共968份,结合血清学检测和问卷调查分析,了解目前我国产蛋鸡群中ARV的血清流行率,寻找蛋鸡感染ARV的风险因素,以期丰富我国产蛋鸡群中ARV的流行病学数据,并可为我国养禽业制定ARV的防控措施提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)标记兔抗鸡IgG,购自北京博奥森生物技术有限公司;脱脂奶粉,购自内蒙古伊利实业集团股份有限公司;缓冲液,购自中科迈晨(北京)科技有限公司;3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine,TMB)显色液,购自广东标允生物科技有限公司;终止液,购自温氏食品集团股份有限公司。ARV抗原,本实验室自制;含吐温-20的磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline with Tween-20,PBST)：在2 L 1×PBS中加入1 mL Tween-20,于磁力搅拌器上搅拌均匀。

1.2 主要仪器和器材 96孔酶标板,购自康宁公司;自动洗板机,购自美国Bio-Rad公司;酶标仪,购自瑞士TECAN公司;-80 ℃超低温冰箱,购自美国Forma Scientific公司;制冰机,购自日本SANYO电气公司;电热恒温培养箱,购自上海蓝豹实验仪器有限公司;磁力搅拌器,购自美国IKA公司。

1.3 样本采集和处理 2022年11月—2023年3月,对北京、天津、河北、山东、河南、江苏、陕西、湖北和重庆9个省市的45个蛋鸡养殖场进行问卷调查,调查内容包括养殖场厂址、鸡群类型、养殖模式、饲养模式、养殖场规模、蛋鸡是否出现ARV感染症状、出现ARV感染症状的日龄和是否接种过ARV疫苗等信息,并由各养殖场随机选择20～35只蛋鸡采集血液,制备血清,每只蛋鸡平均收集0.5～1 mL血清,保存在1.5 mL离心管中,低温运送至实验室,放于-80 ℃冷冻备用,用于血清学检测。

1.4 血清学ELISA检测方法 96孔板包被已纯化的ARV抗原,加入1∶100稀释的血清样本,37 ℃孵育1 h。待血清中的ARV特异性抗体与包被的病毒抗原形成复合物。用PBST洗去孔中未结合的物质,加入HRP标记兔抗鸡IgG,37 ℃孵育30 min,待酶标抗体与孔中附着的血清抗体结合。用PBST洗去未结合的偶联物,加入TMB显色液,10 min后加入终止液。用酶标仪检测并记录各孔在620 nm波长处的吸光度(Optical density,OD)值。

1.5 血清阴阳性临界值的确定 阴阳性临界值=阴性样本OD620 nm值的平均值+2.58×标准差(Standard deviation,SD),若待测血清样本OD620 nm值小于阴阳性临界值则判定为阴性,反之则判定为阳性。

1.6 数据分析 使用Microsoft Excel整理ELISA检测结果,结合调查问卷信息,用SPSS 26 软件对风险因素进行单因素分析和逻辑回归分析,根据P值(Probability value,P-value)和比值比(Odds ratio,OR)判断所分析的风险因素与蛋鸡出现ARV感染症状之间的显著性和关联程度。

2 结果

2.1 ARV感染情况 2022年11月—2023年3月,共从45个采样鸡群收集968份血清样本,采用ELISA方法检测血清样本中ARV特异性抗体,共检测出863份阳性血清,阳性率为89.15%(95% CI：87.0%～91.0%)。在968份血清样本中有80份血清样本采自接种过ARV疫苗的鸡群,ELISA检测结果显示均为阳性血清;其余888份血清采自未接种过ARV疫苗的鸡群,ELISA检测结果显示有783份为阳性血清,阳性率为88.18%(95% CI：85.9%～90.2%)。对于每个采样鸡群,ARV感染率介于10%～100%(表1)。湖北地区、陕西地区、江苏地区、河南地区、天津地区、重庆地区、河北地区、北京地区和山东地区未接种过ARV疫苗的采样鸡群的ARV感染率分别为100%、100%、100%、100%、100%、100%、99.10%、93.98%和56.31%。

表1 采样蛋鸡群ELISA检测结果

在采集的所有血清样本中,采自出现ARV感染症状蛋鸡的血清样本有264份(其中包括接种过ARV疫苗的80份蛋鸡血清样本),ELISA检测结果均为阳性,阳性率为100%(95% CI：98.6%～100.0%);其余704份血清样本采自没有出现ARV感染症状的蛋鸡(同时未接种过ARV疫苗),经ELISA检测,其中有599份为阳性血清,阳性率为85.09%(95% CI：82.2%～87.6%)。

2.2 蛋鸡出现ARV感染症状的风险因素分析 结合调查问卷信息,统计分析不同风险因素与蛋鸡出现ARV感染症状的相关性,结果显示,全进全出饲养模式下的蛋鸡出现ARV感染症状的概率显著低于区域性全进全出饲养模式或不同日龄、不同批次混养饲养模式下的蛋鸡,且存在较强关联(P<0.05,0.1

饲养过程中有野禽出现的蛋鸡出现ARV感染症状的概率高于饲养过程中没有野禽出现的蛋鸡,但统计学差异不显著(P>0.05)。鸡群类型、养殖模式和蛋鸡在出现ARV感染症状前是否进行ARV疫苗免疫的统计学差异均不显著(P>0.05)(表2)。

对单因素分析结果中具有统计学差异的风险因素进行逻辑回归分析,结果显示,饲养模式是蛋鸡出现ARV感染症状的风险因素(P<0.05)(表3)。

3 讨论

本试验结果显示,从产蛋鸡群中收集的968份血清样本的ARV抗体阳性率为89.15%(95% CI：87.0%～91.0%);968份血清中采自未接种过ARV疫苗的蛋鸡血清样本共计888份,其中783份为阳性血清,阳性率为88.18%(95% CI：85.9%～90.2%),未接种过ARV疫苗但体内存在特异性抗体的蛋鸡,其体内抗体的存在归因于ARV感染。本试验测得的蛋鸡群平均血清ARV抗体阳性率与Pu等[16]在2008年报道的我国蛋鸡群平均血清ARV抗体阳性率(92%)相比略低,可能与样本来源、采样方法不同有关。在所有抽样地区中,未接种过ARV疫苗的采样蛋鸡群具有较高的平均血清阳性率(56%～100%),表明ARV感染在我国蛋鸡群中较常见,分析其可能原因包括：ARV在家禽种群中普遍存在,采样蛋鸡群的ARV疫苗接种率普遍偏低,蛋鸡体内不存在具有免疫保护作用的特异性抗体,容易受到环境中ARV的感染[9-10];鸡群使用受污染的疫苗也可能是导致病毒感染在鸡群中高发的原因[16-17],但本试验中并没有对采样鸡群的疫苗进行分析,因此无法确定本试验中采样鸡群血清抗体阳性率较高是否与疫苗有关。本试验中有1个位于北京地区的养殖场,采样鸡群在未出现ARV症状前即接种了ARV疫苗,但之后仍出现ARV感染症状,分析其原因可能为采样鸡群感染的是野毒株,传统的ARV疫苗株无法提供足够的免疫保护作用,验证这一推测需要对发病鸡群进行病毒分离。

本试验血清样本中有704份采自没有出现ARV感染症状且未接种过ARV疫苗的蛋鸡,检测结果显示,704份血清样本中有599份为阳性血清,阳性率为85.09%(95% CI：82.2%～87.6%),表明ARV在采样鸡群中大多呈隐性感染;发病鸡群主要表现病毒性关节炎症状,这与报道一致[9]。根据本试验收集的调查问卷,发病鸡群往往在25日龄后,多于100～200日龄表现出临床症状。

本试验逻辑回归分析结果显示,饲养模式是蛋鸡出现ARV感染症状的风险因素,分析其原因可能是全进全出的饲养模式保障了同一栋鸡舍或同一个养殖场可以在同一时间进入同批同日龄的蛋鸡,在出栏时也可以在同一时间将场内的蛋鸡全部出场,这时整栋鸡舍或养殖场没有蛋鸡存在,可以对环境进行彻底的打扫消毒,降低饮水、饲料和栋舍墙壁表面等环境中的病毒含量,因此相较于不实施全进全出饲养模式的养殖场鸡群,实施全进全出饲养模式的养殖场鸡群出现ARV感染症状的概率较低[16,18]。

本试验单因素分析显示,不同养殖场规模下的生物安全防控差异和员工对鸡舍的消毒意识差异与蛋鸡出现ARV感染症状有关。分析其原因可能是小型养殖场受到资金、人员和场地规模等多因素限制,导致无法给鸡群提供与大、中型规模化养殖场等同的良好的环境管理条件,造成病毒感染率上升[18];当员工具有较强的鸡舍消毒意识时,可有效降低环境中的病毒含量,减少蛋鸡接触环境中ARV的机会,从而降低感染风险[19]。在蛋鸡出现ARV感染症状前是否接种ARV疫苗的统计学差异不显著(P>0.05),可能与本试验样本量较小有关。

综上,本试验结果显示,饲养模式、养殖场规模和员工对鸡舍的消毒意识与产蛋鸡群出现ARV感染症状之间存在显著相关性,提示在ARV的防控中需要重点关注这三方面。