低渗肠内喂养减轻坏死性小肠结肠炎肠上皮损伤及其机制研究

余梦楠,刘钢,黄柳明,封志纯（解放军总医院第七医学中心,出生缺陷防控关键技术国家工程实验室,儿童器官功能衰竭北京市重点实验室,北京 100700）

坏死性小肠结肠炎（Necrotizing enterocolitis，NEC）是常发生于新生儿，尤其是早产和低出生体重儿的胃肠道疾病；严重病例常出现白细胞、血小板下降[1]。NEC在存活新生儿中的发病率在0.5/1000-5/1000[2]，出生体重500-1500g的新生儿发病率可达7%[3]。随着围产医学和儿科学发展、重症新生儿监护病房的建立，早产和低出生体重儿的存活率明显提高，使NEC的发病率不断提升[4-5]。NEC的发生通常认为是由多因素参与、瀑布式进展的消化系统炎症性疾病[4-8]。研究[9]表明，与人工喂养相比，母乳喂养的早产儿NEC发病率降低接近4倍。为了满足早产儿能量需求，往往会提高肠内营养热卡，这使配方奶渗透压增高。高渗性喂养可能损伤早产儿尚不成熟的肠黏膜，诱发NEC发生[10]。有研究[11]发现，以稀释配方奶喂养的早产或低出生体重儿，喂养不耐受发生率明显低于接受未稀释配方奶喂养的患儿，本研究通过以不同渗透压的配方奶喂养大鼠，检测肠道形态学、上皮细胞间紧密连接（tight junction，TJ）蛋白的特点，从而为NEC的预防治疗提供新的理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料 脂多糖、苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）购于武汉谷歌生物科技公司，新生儿暖箱为宁波戴维医疗器械股份有限公司生产，人工喂养采用雀巢早产/低出生体重配方奶粉，自制缺氧箱。闭锁小带蛋白-1（zonula occluden-1，ZO-1）蛋白质免疫印迹法（Western Blot，WB）实验抗体购自Santa公司，闭合蛋白（Occludin，Occ）抗体购自Invitrogen公司，β-Actin抗体及HRP山羊抗兔二抗购自Servicebio公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 将60只出生12小时内SD大鼠标号，交替随机分为对照组、标准配方奶喂养组（标准组）和低渗配方奶喂养组（低渗组），每组20只。对照组乳母鼠同笼、鼠乳喂养；标准组、低渗组大鼠在培育箱中用不同渗透压配方奶粉喂养，为实验组。

1.2.2 NEC模型建立 采用联合人工喂养、缺氧5分钟及胃注脂多糖（4mg/kg）建立NEC模型，建模48小时。

1.2.3 不同渗透压配方奶配制方案 标准奶液为30ml温水+5.37g奶粉（一勺），渗透压256mOsm/kg（厂家标示），低渗奶液30ml温水+2.61g奶粉，计算得出渗透压约为128mOsm/kg。

1.2.4 取材时间及方法 NEC造模后48小时，采取颈椎脱臼法处死全部大鼠，于冰袋上解剖，辨认空肠、回肠、结肠，留取回盲瓣近端2cm回肠。

1.3 统计学分析 统计分析使用IBMSPSS22.0软件进行，组间比较采用独立样本t检验，α=0.05为检验水准；计量资料以(±s)表示。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较 造模过程中各组大鼠无死亡。各组小鼠出生时体重无差异[对照组：（7.40±0.98）g，标准组：（7.36±1.0）g，低渗组：（7.35±0.99）g]，造模48小时后，三组（n=20）平均体重分别为（10.12±0.78）g、（7.29±0.84）g及（7.09±0.97）g（P＜0.05）。对照组大鼠体重稳定增长，进食、排便正常，对外界刺激反应灵敏，无腹胀、吐奶。标准组大鼠部分皮肤发青，表现为懒动、刺激后反应减慢，灌胃时阻力较大、呕吐；无血便及明显腹胀。低渗组部分大鼠出现皮肤发青、活动减少、刺激后反应减慢；未见血便及明显腹胀，胃潴留少见（见图1）。参照Zani提出的大鼠NEC评分方法，对照组0.2分，标准组3.9分，低渗组3分（P＜0.05）。

图1 大鼠肠道形态表现。A：对照组，肠道形态正常；B：低渗组，回肠未见明显扩张、淤血、积气，结肠肠壁积气；C：标准组，回肠扩张且弹性差，肠壁间积气，肠腔内可见气泡

2.2 各组大鼠肠道大体病理比较 对照组大鼠空肠乳白色，回肠淡黄色，弹性好，未见积气积液。标准组部分大鼠可见肠管扩张伴肠壁淤血或积气；结肠病变最重，回肠次之，空肠较轻，肠道大体病理符合NEC表现（见图1）。低渗组部分大鼠肠管扩张，回肠无明显肠壁或积气，部分结肠肠壁积气（见图1）。根据Zani评分，对照组0分，标准组2分，低渗组1分（P＜0.05）。

2.3 各组大鼠肠道组织学病理改变比较 对照组大鼠回肠结构完整，肠黏膜完整连续，肠绒毛多而细长，呈叶状或指状突入肠腔，上皮隐窝丰富，部分存在炎性细胞浸润。标准组肠壁变薄、部分壁内出血，肠绒毛参差不齐并缩短增宽；隐窝减少并部分裸露、结构紊乱。低渗组回肠肠黏膜多完整连续，肠绒毛叶状或指状、表面为单层柱状上皮细胞，固有层内可见炎性细胞浸润（见图2）。

图2 各组大鼠肠组织HE染色结果（×100）。A：对照组，绒毛细长且排列规则，上皮细胞柱状；B：标准组，绒毛缩短脱落；C：低渗组，绒毛细长，结构完整，绒毛固有层内见炎性细胞浸润

光镜下（10×10倍）测量视野中绒毛高度（n=3），对照组（178±5.8）um，标准组（105±6.5）um，低渗组（134±5.4）um，提示NEC时肠上皮绒毛高度缩短，且差异有统计学意义（P＜0.05）。根据Nadler肠组织病理评分标准，对照组（0.5±0.50）分，标准组（1.5±0.55）分，低渗组（0.8±0.54）分，组间存在统计学差异（P＜0.05）。

2.4 各组大鼠肠道上皮超微结构表现 电镜下观察，发现两实验组上皮细胞微绒毛出现破坏（见图3）。在放大倍数为×4.0k时，每组选5个切面、每切面选择10个上皮细胞进行观察，计算微绒毛破坏的上皮细胞占总上皮细胞比率。得出对照组3%，标准组18%，低渗组12%，差异有统计学意义（P＜0.05）。各组上皮细胞间TJ结构存在，部分结构模糊不清（见图3）。在×5.0k放大倍数下为每组各选择10个TJ，平行微绒毛轴对TJ长度进行测量并取平均值（μm），结果为：对照组（0.24±0.01），标准组（0.29±0.01），低渗组（0.26±0.02）（P＜0.05）。

2.5 各组大鼠肠道TJ蛋白表达比较 WB检测发现，随着渗透压增加，ZO-1、Occ表达逐渐降低，其中ZO-1/Actin：对照组（0.66±0.04），标准组（0.06±0.015），低渗组（0.18±0.03），P＜0.05。Occ/Actin：对照组（2.13±0.2），标准组：（0.14±0.005），低渗组（0.97±0.025），P＜0.05（见图4）。

图4 各组大鼠回肠中ZO-1、Occ的蛋白表达水平

3 讨论

高渗透性婴儿配方奶可导致渗透性腹泻的发生，并诱发NEC发生。Basuki[11]等人报道，降低配方奶渗透压可使早产或低出生体重儿出现喂养不耐受、呕吐或腹胀的现象减少，并较快达到全肠内营养。笔者发现，以稀释配方奶喂养NEC高危患儿，逐渐加量到一定程度，再以正常配方奶喂养，可使NEC发生率降低。

本研究发现新生大鼠接受人工喂养、缺氧及LPS灌胃48小时后，肠道可以出现NEC样变化，包括肠管扩张、积气，肠道上皮细胞出现绒毛脱落、缩短，微绒毛破坏比率增加，上皮细胞间TJ长度增长等变化；在蛋白水平，实验组大鼠TJ蛋白表达下降。对于缺氧及存在细菌负荷的大鼠，低渗配方奶可减轻肠道损伤。与标准配方奶喂养相比，低渗组大鼠的肠绒毛长度较长；超微水平可观测到肠上皮微绒毛破坏较少。在超微水平另一主要发现是两实验组较对照组TJ长度增加，而低渗组TJ长度的增加要低于标准组。此外还发现，低渗喂养可减轻实验条件下TJ蛋白ZO-1和Occ的表达下调。

TJ位于上皮细胞顶端及侧膜，起到调节细胞通道的作用，也通过阻断脂类及蛋白质自由扩散，保持细胞极性。TJ是最重要的肠机械屏障结构，决定肠黏膜通透性。研究发现，肠道通透性增高出现在肠道组织形态发生变化之前。如胃注FITC标记的右旋糖酐后，可在12小时、24小时在血液中检测出[12]；处理24小时后，上皮细胞组织学无损伤表现而上皮通透性增加，提示此时可能发生TJ缺陷。电镜观察到母乳组及NEC组上皮细胞间TJ结构均完整，而TJ从顶端到基底外侧的长度在NEC组约为（0.31±0.02）um，母乳组约（0.25±0.01）um，NEC组比母乳组长约23.6%，提示TJ结构重塑[12]。Occ是最初发现的完整TJ蛋白，其功能尚不完全清楚，目前认为它在维持肠上皮TJ结构和通透性中发挥重要作用。ZO蛋白是最早发现的TJ特异性蛋白之一，有三个组成蛋白，包括ZO-1、ZO-2和ZO-3。ZO有许多结构域，其N末端与许多TJ蛋白结合，C末端连接肌动蛋白细胞骨架和细胞骨架相关蛋白，发挥维持和调节TJ结构的作用。TJ结构和功能的完整性呈动态变化，许多因素可影响其完整。早产儿TJ相对于足月儿发育不成熟，上皮屏障的破坏可导致早产儿出现NEC的风险增高。

肠上皮屏障出现功能异常不仅使早产儿更容易发生NEC，还可使肠道损伤和炎症程度更重，从而使NEC严重程度增加。当前研究发现，适当的TJ组成蛋白表达和在不成熟肠道中的分布，可使实验NEC的发生风险和严重程度降低。本研究发现，应激状态下人工喂养大鼠TJ家族蛋白表达下降，而降低配方奶渗透压可减轻这一变化，这可能在预防NEC的发生中具有实用临床价值。未来研究中，确定TJ哪些核心成分异常可增加NEC发生风险或加重其严重程度，可能是确定治疗时机和选择治疗方式的重要手段。