非肌层浸润性膀胱癌患者外周血单核细胞及尿沉渣中NLRP3的表达及意义

李慎谟 单中杰

郑州人民医院泌尿外科,河南省郑州市 450000

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一,近年来其发病率呈逐年上升趋势。在我国膀胱癌发病率居泌尿系统肿瘤首位,其中非肌层浸润性膀胱癌(Non muscle invasive bladder cancer, NMIBC)患者约占初发膀胱癌的75%[1-2]。目前,临床上关于膀胱癌的诊断主要采用膀胱镜和尿脱落细胞学检查,但具有微创或灵敏度不高等特点,导致其在临床应用均具有一定的局限性[3]。因此,寻找早期诊断和判断预后的新指标对于膀胱癌的早期诊断和复发的监测具有重要意义。

NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(nucleotide binding oligomerization like receptor family pyrin domain containing3, NLRP3)是近年来发现的先天性免疫受体NLRs家族的重要成员,主要分布于细胞间质和细胞膜中[4]。NLRP3与凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated apeck-like protein containing a CARD domain, ASC)、半胱天冬氨酸酶-1等蛋白质分子组装形成多聚复合物——炎症小体,在免疫和炎症反应中发挥重要作用[5]。研究表明,NLRP3炎症小体的异常活化与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关[6-7]。本研究主要是对膀胱癌患者外周血细胞及尿沉渣中NLRP3基因的表达水平进行检测,以探讨其对膀胱癌的早期诊断和复发的监测价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年1月—2017年12月我院收治的初发膀胱癌患者68例为膀胱癌组。纳入标准：均为初发膀胱癌;行经尿道膀胱肿瘤电切术;术后病理证实为非肌层浸润性膀胱癌。其中男48例,女20例,平均年龄(59.44±7.69)岁,根据2004 WHO分类进行肿瘤分级,中低度恶性潜能乳头状尿路上皮肿瘤16例,低级别乳头状尿路上皮癌23例,高级别乳头状尿路上皮癌29例,按照2009 TNM分期系统确定肿瘤分期分为Ta期30例,T1期38例。选取同期来我院治疗的泌尿系统良性病变(膀胱炎、膀胱结石、前列腺增生等)患者60例为良性病变组,其中男39例,女21例,平均年龄(57.63±7.67)岁。选取同期来我院健康体检的健康人60例为对照组,即血常规、尿常规检查无异常,无其他泌尿系统及免疫性疾病。其中男42例,女18例,平均年龄(58.93±7.83)岁。三组一般资料比较无统计学差异(P>0.05),具有可比性。所有受试者均对本研究知情同意并签署知情同意书,且本研究经本院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 资料收集及随访。收集所有受试者的临床资料,包括年龄、性别、膀胱癌的分级及TNM分期等。同时对膀胱癌患者进行术后随访：术后采用电话或门诊定期进行随访,术后1年内每个月1次,此后每3个月1次,随访截止至2019年12月。无进展生存时间为手术日至膀胱癌复发、死亡或随访截止日。

1.2.2 样本采集。所有受试者留取尿液前1周内均未接受膀胱镜检查或导尿术等刺激性操作。采集膀胱癌患者手术当日空腹静脉血和晨起中段尿各5～10mL,良性病变和健康者检查或体检当日空腹静脉血和晨起中段尿5～10mL。

1.2.3 血细胞和尿沉渣总RNA的提取。采用Ficoll-Hypaque密度分离法提取外周血单核细胞。将尿液标本在4℃下3 000r/min离心10min,收集沉淀。将分离得到的单核细胞及尿沉渣采用PBS洗涤后,加入300μL裂解缓冲液,采用BIOG细胞RNA提取试剂盒提取外周血单核细胞及尿沉渣中总RNA,严格按照试剂盒说明书进行操作。以总RNA为模板,按照TaKaRa逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA,-20℃冻存备用。

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链反应法(RT-qPCR)检测NLRP3 mRNA的表达。采用Primer5.0设计引物,序列如下：NLRP3 上游引物：5’-CGGGGCCTCTTTTCAGTTCT-3’,下游引物：5’-CCCCAACCACAATCTCCGAA-3’;β-actin 上游引物：5’-ATCGTGCGTGACATTAAGGAG-3’;下游引物：5’-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3’,由上海生工生物工程公司合成。以β-actin为内参,采用SYBR Green ER qPCR SuperMix(Applied Biosystems,USA)试剂盒进行qRT-PCR检测NLRP3 mRNA的表达。反应条件为：95℃ 5min,95℃ 30s,55℃ 30s,40个循环;最后72℃延伸5min。采用2-ΔΔCt计算NLRP3 mRNA的相对表达量。

2 结果

2.1 外周血单核细胞和尿沉渣NLRP3 mRNA的表达 如表1所示,三组受试者外周血单核细胞及尿沉渣NLRP3 mRNA的表达量具有统计学差异。组间两两比较,膀胱癌组和良性病变组患者外周血单核细胞及尿沉渣NLRP3 mRNA的表达量明显高于对照组;膀胱癌组尿沉渣NLRP3 mRNA的表达水平明显高于良性病变组,而外周血单核细胞NLRP3 mRNA的表达水平在两组之间无统计学差异。

表1 三组患者血细胞及尿沉渣NLRP3 mRNA的表达水平

2.2 NLRP3对膀胱癌的诊断效能 采用ROC曲线分析外周血单核细胞及尿沉渣中NLRP3的表达水平对膀胱癌的诊断效能。外周血单核细胞及尿沉渣中NLRP3诊断膀胱癌的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.754和0.922,外周血单核细胞NLRP3诊断的敏感性高于尿沉渣NLRP3,而特异性显著低于尿沉渣NLRP3。见图1和表2。

图1 ROC曲线分析血细胞及尿沉渣中NLRP3表达水平对膀胱癌的诊断价值

表2 ROC曲线分析结果

2.3 NLRP3与膀胱癌患者临床资料的相关性 根据ROC曲线分析结果,以外周血单核细胞NLRP3的表达水平1.20为最佳界限值,将膀胱癌患者分为高表达组和低表达组,比较两亚组间膀胱癌患者的临床特征资料,见表3。结果发现,两组患者在年龄、性别方面无统计学差异(P>0.05),但在膀胱癌分级及TNM分期方面具有统计学差异(P<0.05)。同样以尿沉渣NLRP3的表达水平1.23为最佳界限值将膀胱癌患者分为高表达组和低表达组,结果同样发现,尿沉渣NLRP3的表达水平与膀胱癌的分级及TNM分期具有明显的相关性(P<0.05)。

表3 NLRP3与膀胱癌患者临床资料的相关性[n(%)]

2.4 NLRP3与膀胱癌患者预后的相关性 所有膀胱癌患者术后进行随访,随访时间为12～48个月,中位随访时间为33.5个月。随访期间共有18例膀胱癌患者复发或死亡,无进展生存率为73.5%。进一步采用Kaplan-Maier方法分析NLRP3的表达与预后的关系,见图2。结果发现,外周血单核细胞NLRP3低表达组患者的无进展生存率为85.7%,而高表达组的无进展生存率为70.4%,两组间无明显差异(χ2=2.127,P=0.145)。而尿沉渣NLRP3低表达组患者的无进展生存率为90.5%,高表达组的无进展生存率为66.0%,组间具有显著差异(χ2=4.239,P=0.040)。

图2 各组生存曲线的比较

3 讨论

研究表明,炎症反应在肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用,而NLRP3炎症小体作为目前研究最为广泛的炎症蛋白,一方面能够促进IL-1β、IL-18等炎性因子的分泌及细胞凋亡的发生,另一方面也可以介导抗肿瘤的免疫应答反应,在多种疾病的发生发展及预后中具有重要作用[5,8-9]。国内学者郑娟红等[10]发现在重症溃疡性结肠炎患者血清中NLRP3 mRNA表达水平显著升高,参与其临床病理过程。在结直肠癌组织中,NLRP3的表达上调,与TNM分期、远期转移、淋巴结阳性及预后有关,是结直肠癌预后的生物标志物也是其潜在治疗靶点[11]。何登等[12]研究发现,NLRP3炎症小体在宫颈癌组织中表达量异常增高,与肿瘤增殖、侵袭基因的表达有关,过表达NLRP3可以促进肿瘤细胞的增殖、侵袭,影响宫颈癌病程的进展。国内学者张惟等[13]研究也发现膀胱癌组织和细胞系中NLRP3的表达升高,其表达水平与膀胱癌患者的病理分期、淋巴结转移及肿瘤分级相关。国外研究也指出在膀胱癌患者尿沉渣中炎症小体表达升高[14]。目前国内外的研究大多集中于研究NLRP3炎症小体的激活与肿瘤发生发展的关系及其可能的机制,但关于NLRP3在膀胱癌中表达的相关研究较少,其临床意义仍不够明确。

本研究结果显示,膀胱癌组和良性病变组患者外周血单核细胞及尿沉渣NLRP3 mRNA的表达量明显高于对照组,且膀胱癌组尿沉渣NLRP3 mRNA的表达水平明显高于良性病变组,提示尿沉渣NLRP3可能在慢性炎症发展为肿瘤的过程中发挥了一定的作用。ROC曲线分析发现,外周血单核细胞及尿沉渣NLRP3诊断膀胱癌的AUC分别为0.754和0.922,且尿沉渣NLRP3的诊断特异性显著高于外周血单核细胞NLRP3,提示NLRP3可能是膀胱癌临床诊断的新的肿瘤标记物,与汪晓巍等[15]的研究结果较为一致。但联合检测外周血单核细胞和尿沉渣中NLRP3的表达,能够进一步提高膀胱癌临床诊断的灵敏度。同时本研究结果还发现,外周血单核细胞及尿沉渣NLRP3的表达水平与膀胱癌的分级及TNM分期具有明显的相关性,提示NLRP3的表达水平与膀胱癌的进展有关,与现有研究结果较为一致[13]。进一步的Kaplan-Meier生存分析发现,外周血单核细胞NLRP3低表达组和高表达组的无进展生存率分别为87.5%和70.4%,无明显差异(P>0.05),而尿沉渣NLRP3 mRNA低表达组的无进展生存率为90.5%,显著高于高表达组的66.0%(P<0.05),提示尿沉渣NLRP3对膀胱癌的预后具有一定的预测价值。

综上所述,NLRP3在膀胱癌患者的外周血细胞及尿沉渣中高表达,与膀胱癌的发生发展及预后均具有一定的相关性,提示NLRP3可能是一个潜在的膀胱癌临床诊断的候选肿瘤标记物,并且对膀胱癌的预后均具有一定的预测作用。但仍需要大样本、多中心的研究及进一步明确NLRP3的诊断价值,为膀胱癌的诊断及复发监测提供新的方法。