华蟾素对人胃癌MKN-28细胞增殖、凋亡的影响研究*

叶 磊 郑梓莹 陈 文 陈毅菁

福建医科大学附属第二医院中西医结合肿瘤科,福建省泉州市 362000

胃癌是我国常见的癌症之一,中医药已被广泛用于胃癌的治疗,由于其独特的优势,中医药不仅可以显著改善患者的症状,并可以在一定程度上逆转恶性肿瘤的病理恶化,从而防止肿瘤进一步发展[1]。华蟾素作为一种从中华巨型蟾蜍的表皮分泌物中提取的天然类固醇内酯,被认为具备清热解毒以及消肿止痛的功效,对改善恶性肿瘤的预后具有重要价值[2]。许多体内外的研究表明,华蟾素具有抗肿瘤活性和增强化疗效果的特性[3]。一项荟萃分析指出,华蟾素联合化疗方案治疗胃癌比单独化疗更为有效,可明显减轻化疗相关的不良反应,并改善胃癌患者的生活质量[2]。尽管华蟾素在临床上已被广泛应用,但其抗肿瘤的分子机制目前仍未完全明确。因此,本实验选用人胃癌MKN-28细胞系,从基础实验层面,探究华蟾素对胃癌细胞增殖和周期的影响,并进一步探索华蟾素对胃癌MKN-28细胞系凋亡相关蛋白表达量的影响,从而明确其抗癌机制,为华蟾素治疗胃癌的应用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 细胞、试剂 人胃癌MKN-28细胞购自上海(江西)中洪博元生物技术有限公司。华蟾素(1108-68-5,德思特生物)由中洪博元提供。本实验所需试剂包括RPMI-1640完全培养基(KGM31800S,KeyGen Biotec);RPMI-1640不完全培养基(KGM31800N,KeyGen Biotec);OPTI-MEM培养基(31985-062,Gibco);胰蛋白酶-EDTA消化液(T1300,Solarbio); CCK8-法细胞增殖检测试剂盒(KGA317-2,KeyGen Biotec);Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit(AP101-100-kit,MΜLTI SCIENCES);Cell Cycle Staining Kit(CCS102,MΜLTI SCIENCES);PVDF膜(IPVH00010, Millipore);超敏发光液(RJ239676,赛默飞);Mouse Anti-β-Actin(HC201,TransGen Biotech);HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(GB23301,Servicebio);Rabbit Anti Bcl-2 (ab194583,Abcam);Rabbit Anti BAX (ab32503,Abcam);Rabbit Anti Caspase-3 (ab59425,Abcam);HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(GB23303,Servicebio)。

1.2 实验仪器 CO2培养箱(BPN-80CW,上海一恒科学仪器有限公司);倒置荧光显微镜(MF53,广州市明美光电有限公司);洁净工作台(BBS-SDC, BIOBASE);多功能酶标分析仪(SuPerMax3100,上海闪谱生物科技有限公司);显微镜(BX43,Olympus);NovoCyteTM流式细胞仪[NovoCyte 2060R,艾森生物(杭州)有限公司];全自动化学发光图像分析系统(Tanon-5200,上海天能科技有限公司)。

1.3 细胞培养及药物处理 人胃癌MKN-28细胞经复苏、解冻后,采用含10%胎牛血清和1%青霉素—链霉素双抗的RPMI-1640培养。细胞培养条件：含5%浓度的CO2、37℃、饱和湿度的孵箱。细胞培养液隔天换液1次,待细胞密度至80%～90%时需对细胞进行传代,每2～3d传代1次。取对数生长期的MKN-28细胞用于后续实验。在Cell Counting Kit-8实验(CCK8法)前,弃去细胞培养上清,用1×PBS洗两遍,加入0.25%胰酶(含0.02% EDTA)消化,待细胞变圆加入培养基终止消化并收集细胞悬液至10mL离心管中,1 000r/min离心3min,弃去上清液加入培养基重悬细胞进行传代。

1.4 细胞增殖活力检测 通过CCK8法检测细胞增殖活力。细胞培养至状态良好,行细胞计数后,将细胞悬液分配至96孔板中,做好标记,将细胞置于培养箱中24h;待细胞贴壁后,更换新鲜培养基,每孔100μL,不同孔分别加入0μg/mL、0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.04μg/mL、0.08μg/mL、0.16μg/mL、0.24μg/mL、0.32μg/mL、0.48μg/mL及0.64μg/mL浓度的华蟾素,继续培养24h后更换培养基,向各孔中加入10μL CCK8试剂,于培养箱中孵育2h,在450nm波长下用酶标仪测定各孔吸光度值,计算IC50。待CCK8法计算半抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)后,根据IC50值将MKN-28细胞进一步分为对照组(Control)和实验组(华蟾素处理,Cinobufagin),对照组只加入DMSO,而实验组加IC50浓度华蟾素处理24h,后续进行对应检测。

1.5 流式细胞凋亡检测 收集1×106个细胞,1 500r/min 离心3min后,采用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤两遍;取300μL 预冷的1×Annexin V-FITC结合液重悬细胞,向各孔中加入5μL Annexin V-FITC 和 10μL PI;轻微混匀后,在室温条件下,避光孵育10min,用流式细胞仪进行检测细胞凋亡状态。

1.6 流式细胞周期检测 收集1×106个细胞,1 500r/min 离心3min后,采用PBS洗涤两遍,按照细胞周期检测试剂盒说明书,向各孔加入细胞周期检测试剂,在室温条件下,避光孵育30min,用流式细胞仪检测细胞周期。

1.7 Western Blot检测 实验组和对照组MKN-28培养细胞弃去培养基,加入RIPA裂解液裂解细胞,提取总蛋白。12 000r/min高速离心机4℃离心10min,取上清液,BCA蛋白定量试剂盒对总蛋白进行定量。对蛋白样品进行变性后,进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳(SDS-PAGE)1h,后用300mA恒流转膜1.5h。PVDF膜用脱脂奶粉封闭后,一抗4℃孵育过夜,次日PVDF膜室温孵育二抗2h,用发光液浸湿PVDF膜,置于全自动化学发光图像分析系统中进行显影。所使用的抗体及对应稀释倍数见表1。

表1 Western Blot检测抗体信息表

2 结果

2.1 CCK8检测华蟾素对胃癌细胞增殖的影响及IC50测定 随华蟾素处理浓度的增加,细胞增殖能力逐渐下降,与浓度呈负相关,其中,与0μg/mL组相比,浓度≥0.02μg/mL的华蟾素即可以达到显著抑制胃癌细胞增殖的能力(P<0.05)。采用Graphpad prism 8.0计算MKN-28细胞最佳药物处理浓度为0.16μg/mL。见表2。

表2 不同华蟾素作用浓度对胃癌MKN-28细胞的增殖影响

2.2 流式细胞凋亡检测 对照组胃癌细胞凋亡比例为(7.87±0.50)%,而实验组凋亡比例为(16.62±1.21)%,两组比较差异具有统计学意义(t=11.62,P=0.002)。

2.3 流式细胞周期检测 经华蟾素处理后,实验组G0/G1期细胞所占比例显著增加,而G2/M期细胞所占比例显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。实验组S期细胞所占比例减少,但差异无统计学意义(P=0.078),说明华蟾素可以将MKN-28增殖阻滞在G1期。见表3。

表3 华蟾素对胃癌MKN-28细胞细胞周期的影响

2.4 细胞凋亡相关蛋白Western Blot检测结果 经过华蟾素处理后,MKN-28细胞中,Bcl-2蛋白表达量显著上升(P=0.002),而Bax、Caspase-3表达量则显著下降(P<0.05)。见表4。

表4 华蟾素对胃癌MKN-28细胞凋亡相关蛋白相对表达量的影响

3 讨论

胃癌是全球第五大常见癌症,也是全球癌症死亡的第四大原因[4]。胃癌对我国人民的生命造成了巨大的威胁,根据2019年全球疾病负担研究,中国的胃癌发病率占全球胃癌总数的44.21%,同时胃癌是中国第二大常被诊断的癌症,也是癌症相关死亡的第二大原因[5]。随着医疗技术的进展和抗肿瘤药物的出现,胃癌的预后较前有了明显改善,但鉴于化疗的耐药性与毒副作用,临床医生一直在探索传统中药治疗胃癌的效果,以提高患者的生存时间或生活质量,减少化疗引起的副作用[6-7]。华蟾素几十年来一直作为经典的辅助疗法在临床上应用[8]。有多项临床研究报告表明,华蟾素可能对胃癌具有一定的治疗效果[2],但有关华蟾素发挥抗胃癌的具体机制尚未明确[9]。

一些研究表明,华蟾素可以抑制人胃癌BGC-823细胞的侵袭、迁移能力[10],也可以抑制人胃癌SGC7901细胞的增殖,并通过下调Rho GTPase(RhoA、Cdc42、Rac1)信号通路的表达发挥抗肿瘤作用[11]。然而,华蟾素对人胃癌 MKN-28细胞系是否有同样的抑制作用尚未得到报道。在本研究中,笔者以胃癌 MKN-28细胞作为研究对象,采用不同浓度的华蟾素进行干预治疗,采用CCK8法检测华蟾素对胃癌 MKN-28细胞增殖活力的影响。结果显示,随华蟾素药物浓度的增加,MKN-28细胞增殖活力逐渐下降,其增殖活力与浓度呈负相关,提示华蟾素对胃癌MKN-28细胞株亦有显著抗癌作用。基于CCK8检测结果,我们测算出华蟾素对MKN-28细胞的IC50值为0.16μg/mL,即采用0.16μg/mL浓度的华蟾素对MKN-28细胞具有50%的抑制效应,该值通常作为细胞实验的理想药物浓度。

进一步研究显示,采用0.16μg/mL浓度的华蟾素干预胃癌MKN-28细胞株后,实验组凋亡比例为(16.62±1.21)%,而对照组为(7.87±0.50)%,说明华蟾素具有促进胃癌MKN-28细胞凋亡的作用。此外,经华蟾素处理后,实验组G0/G1期细胞所占比例显著增加,而G2/M期细胞所占比例显著降低,说明华蟾素可以将MKN-28增殖阻滞在G1期,而既往已有大量研究表明,G2/M期细胞比例与肿瘤活性显著相关,G2/M期比例越高,说明肿瘤增殖活性越高,恶性程度越高[12]。本研究结果表明,华蟾素可以通过降低胃癌MKN-28细胞G2/M期细胞比例而降低肿瘤增殖活性,降低其恶性程度。笔者进一步通过Western Blot技术检测了华蟾素处理后细胞凋亡相关蛋白的表达差异。结果发现,经过华蟾素处理后,MKN-28细胞中,Bcl-2蛋白表达量显著上升,而Bax、Caspase-3表达量则显著下降,表明华蟾素促进了胃癌细胞的凋亡。

华蟾素发挥抗肿瘤的机制还有待进一步阐明。既往研究表明,信使RNA(mRNA)和小非编码RNA分子(miRNA)可能是华蟾素发挥抗肿瘤作用的重要靶分子之一[13]。其中,miRNA可通过上调或下调靶点而发挥基因调控的作用,目前学界公认miRNA调控是癌症发生、发展和侵袭的关键因素[14]。近几十年来,中药的各种生物活性成分在调节miRNA中的应用越来越受到关注[15]。本研究的结果,即IC50值的确定,将为探索华蟾素对胃癌MKN-28细胞转录组的影响奠定研究基础,未来我们可以在此基础上探讨华蟾素抗胃癌的作用机制。

总之,华蟾素能使人胃癌细胞MKN-28的增殖能力下降,诱导凋亡,阻滞胃癌进展相关的细胞周期,具有作为潜在抗癌药物的开发价值;但华蟾素具体抗癌机制仍有待后期进一步研究。