泰山黄精寄生真菌的分离鉴定

穆淑媛 付均惠 秦 宁 董 斌 庞献伟 仉 劲

黄精（Polygonatum sibiricumRed.）， 又 名 老 虎姜、仙人余粮，为百合科黄精属多年生草本植物，是泰山四大名药之一，在国内享有盛誉。黄精以其根茎入药，具有补气养阴、健脾润肺、益肾的功效，在我国已有2 000 多年的药用历史。 其根茎富含多糖、脂肪、蛋白质、胡萝卜素、维生素等，兼具药用和食用价值， 国内研发了多种具有保健功能的黄精食品、饮品、护肤品等。目前在四川、贵州、安徽、河南、辽宁等地已有规模化人工栽培，山东泰安、威海等地也得到快速发展。但随着集中栽培规模的不断扩大，黄精病害也日益严重，影响了黄精的产量和质量。已报道的黄精病害主要有叶斑病、炭疽病、叶枯病、根腐病、花腐病、病毒病等，以真菌病害为主，但目前对泰山黄精病害的研究较少。 笔者对泰安市林业局实验林场人工栽培的泰山黄精的寄生真菌进行了分离与鉴定，为病害防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 2021 年6 月，在泰安市林业局实验林场黄精栽培基地采集泰山黄精病株7 株。

1.2 方法

1.2.1 真菌分离 将不同症状的病叶、 病根用清水清洗晾干后，用75%酒精浸没消毒30 s，0.1%升汞浸没消毒1 min，无菌水清洗3 遍，用无菌吸水纸吸取叶片水分后， 剪取病健交界部放到PDA 培养皿上，28 ℃避光培养3~5 d， 观察同一培养物上长出的菌落颜色、形状等是否相同，若有则进一步分离纯化，直至长出单一菌落。

1.2.2 形态学鉴定 观察PDA 培养基上菌落的颜色、形态变化，并在光学显微镜下观察记录孢子形态特征。 查阅《真菌鉴定手册》等，初步鉴定菌株种类。

1.2.3 分子生物学鉴定 用真菌基因组DNA 提取试剂盒（购自北京索莱宝科技有限公司）提取菌株的基因组DNA。 ITS 序列PCR 扩增体系：2.5 μL 10×PCR Buffer、2 μL dNTPs（10 mmol/L）、1 μL ITS1、1 μL ITS4、0.25 μL Taq 酶、1 μL DNA 模板，17.25 μL ddH2O。 扩增程序：94 ℃4 min，94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，33 个循环，72 ℃10 min，4 ℃保存。 ITS 序列通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') 的合成及PCR 反应产物测序均由深圳华大基因科技服务有限公司完成。通过NCBI-Nucleotide BLAST 分析测序结果， 以相似度最高的序列作为参考序列，根据Per.Ident 值确定目的菌株分类地位。

2 结果与分析

2.1 寄生真菌分离结果 从采集样品中共分离出18皿真菌（图1），对分离出的寄生真菌菌落形态特征观察记录并统计（表1），分析可知，18 株菌株可归为11组。

表1 泰山黄精寄生真菌的菌落数统计和菌落形态

图1 泰山黄精寄生真菌的菌落形态图

2.2 分子生物学鉴定结果 由表2 可知， 各菌株ITS 序列与参考序列的相似值均超过99%， 可初步认定为同一种。 综合分析表1~2、图2 可知，分离出链格孢属真菌共7 株，占菌落总数的38.89%，其中包括细极链格孢菌2 株，交互链格孢菌5 株；分离出刺盘孢属真菌共6 株，占菌落总数的27.78%，其中包括旋卷葱刺盘孢菌2 株、山茶刺盘孢菌2 株、胶孢炭疽菌1 株； 镰刀菌属真菌2 株， 占菌落总数的11.11%；此外还分离出聚生小穴壳菌、高粱附球菌、Diaporthe eres、数丝顶多毛孢各1 株。

表2 寄生真菌ITS 序列在NCBI 库中的比对结果

因此，可初步认定，泰安市林业局实验林场人工栽培黄精的优势寄生种为链格孢属真菌和刺盘孢属真菌， 且有包括镰刀菌在内的其他多种寄生真菌混合侵染。

3 讨论与结论

本研究确定泰山黄精的叶部病害主要致病菌为链格孢属和刺盘孢属真菌。 刺盘孢属真菌能引起黄精炭疽病，但对叶斑病病原菌研究有不同观点，主要认为叶斑病的病原菌有交互链格孢菌（A.alternata）、细极链格孢菌（A.tenuissima）、叶点霉属（Phyllostictasp. sp）等。 因此，根据本次分离鉴定结果和发病症状，初步认为链格孢菌侵染泰山黄精引起叶斑病、刺盘孢属真菌引起黄精炭疽病， 在防治泰山黄精病害时，应以链格孢属和刺盘孢属真菌为主，筛选敏感药剂，提高防治效果。