北虫草饮品配方优化及其理化特性

赵欢，杨晓静，贺晓龙，2*，王晓涧，2，赵瑞华，2，高瑜，罗继分

（1.延安大学 生命科学学院，陕西 延安 716000；2.陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，陕西 延安 716000；3.延安菌舰生物科技有限公司，陕西 延安 716000）

北虫草[Cordycepsmilitaris（L.exFr.）Link.]属于真菌门，子囊菌纲，肉座菌目，麦角菌科，虫草属[1]，在许多国家被视为功能性食品[2]。野生的虫草已被证明可以寄生于鳞翅目昆虫蛹[3]，为了对其进行驯化，科研工作者利用在蚕蛹中接种子囊菌，成功获得蛹虫草子实体（人工培养）[4-5]。北虫草中含有丰富的营养物质和功能性化合物，如虫草素、多糖、腺苷、麦角甾醇、D-甘露醇等，具有抗疲劳、抗衰老、抑菌和增强免疫力（防止肺部、肝脏和肾脏的恶化）等功效[6-8]。麦角甾醇是脂溶性维生素D的前体，可以有效减少细胞炎症并诱导细胞凋亡[9]。虫草素常被用作虫草品质控制的有效化学标记[10]，北虫草中多糖具有广泛的生物学和药理学功能，包括免疫活性、抗氧化活性、抗肿瘤活性和抗炎活性等[11]。

以北虫草、木糖醇、六偏磷酸钠、柠檬酸、D-异抗坏血酸钠等为原辅料，通过单因素试验与响应面试验对北虫草饮品进行最优配方确定，通过构建偏最小二乘法判别分析（partial least-squares discrimination analysis，PLS-DA）模型获得对北虫草饮品品质贡献率较大的差异性成分。研发一款增添北虫草特有营养成分与色泽香味的饮品，以期为北虫草的深加工与研发高附加值产品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与设备

北虫草：选育自延安大学生命科学学院食药用菌实验室；麦芽糖醇（≥99%）：河南久洲食品有限公司；木糖醇（≥99%）：山东福田药业有限公司；羧甲基纤维素钠（≥99%）、六偏磷酸钠（≥98%）：国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸（≥99%）：上海鑫泰实业有限公司；D-异抗坏血酸钠（≥98%）：河南糖柜食品有限公司；

多功能料理机（JYL-C91T）：九阳股份有限公司；恒温水浴锅（HH-80）：常州市亿能实验仪器厂；高压蒸汽灭菌锅（BKQ-B50II）：济南欧莱博科学仪器有限公司；电子天平（BL-220H）：岛津企业管理（中国）有限公司；超净工作台（BBS-SSC）：山东高芯生物传感器研究院有限公司；紫外分光光度计（UV-1600B）：翱艺仪器（上海）有限公司；分散均质机（FJ200）：上海科晓科学仪器有限公司；自吸式粉碎机（JYL-C91T）：广州市旭朗机械设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 配方设计

经过前期预试验，以添加北虫草粉7%、麦芽糖醇2%、木糖醇2.6%、羧甲基纤维素钠0.03%、六偏磷酸钠0.03%、柠檬酸0.15%、D-异抗坏血酸钠0.06% 为基础配方。以北虫草饮品的感官评分为标准，将羧甲基纤维素钠和六偏磷酸钠、北虫草粉、麦芽糖醇和木糖醇、柠檬酸和D-异抗坏血酸钠的添加量设置为4 个因素，通过单因素试验与响应面法进行配方优化。

1.2.2 工艺流程

北虫草粉→混料→加入木糖醇、羧甲基纤维素钠等辅料调配→均质→脱气→罐装→杀菌→静置冷却→成品。

1.2.3 工艺要点

1.2.3.1 辅料选择与处理

选用延安大学生命科学学院食药用菌实验室选育的北虫草，符合标准质量要求，将北虫草除杂后用自吸式粉碎机粉碎5 min（过200 目筛），得到北虫草粉。

1.2.3.2 北虫草液制作

将处理好的北虫草粉与水按照料液比1∶35（g/mL）混合，用多功能料理机搅拌5 min，待其无明显颗粒时，收集北虫草液备用。

1.2.3.3 混料

在多功能料理机中缓慢加入麦芽糖醇、木糖醇、羧甲基纤维素钠、六偏磷酸钠、柠檬酸、D-异抗坏血酸钠、60～80 r/s 搅拌2 min 后，缓慢加入处理好的北虫草液，搅拌均匀。

1.2.3.4 均质

利用分散均质机使混料在25 MPa 压力条件下进行均质，使混料更加均匀。

1.2.3.5 罐装杀菌

将均质后的样品罐装并放置在高压蒸汽灭菌锅，在100 ℃高温条件下进行灭菌30 min。

1.2.3.6 冷却

由于灭菌后的北虫草饮品残留温度较高，所以应进行冷却处理，待其冷却至50 ℃进行特性指标测定。

1.3 感官评价

参考贾金辉等[12]的方法并稍作修改，选取10 名评价人员对北虫草饮品的色泽、形态、风味、口感、组织状态5 个方面进行感官评分，评分标准见表1。

1.4 单因素试验设计

1.4.1 羧甲基纤维素钠和六偏磷酸钠添加量的确定

北虫草粉添加量为7%，麦芽糖醇添加量为2%；木糖醇添加量为2.6%；柠檬酸添加量为0.15%；D-异抗坏血酸钠添加量为0.06%，以感官评分为标准，设置羧甲基纤维素钠和六偏磷酸钠（质量比1∶1）添加量为0.01%、0.02%、0.03%、0.04% 和0.05%，得出最优羧甲基纤维素钠和六偏磷酸钠添加量范围。

1.4.2 北虫草粉添加量的确定

麦芽糖醇添加量为2%；木糖醇添加量为2.6%；羧甲基纤维素钠添加量为0.03%；六偏磷酸钠添加量为0.03%；柠檬酸添加量为0.15%；D-异抗坏血酸钠添加量为0.06%，以感官评分为标准，设置北虫草粉添加量为7%、9%、11%、13%、15%，得出最优北虫草粉添加范围。

1.4.3 麦芽糖醇和木糖醇添加量的确定

北虫草粉添加量为7%，羧甲基纤维素钠添加量为0.03%；六偏磷酸钠添加量为0.03%；柠檬酸添加量为0.15%；D-异抗坏血酸钠添加量为0.06%，以感官评分为标准，设置麦芽糖醇和木糖醇（质量比1∶1.3）添加量为3%、4%、5%、6% 和7%，得出最优麦芽糖醇和木糖醇添加量范围。

1.4.4 柠檬酸和D-异抗坏血酸钠添加量的确定

北虫草粉添加量为7%，麦芽糖醇添加量为2%；木糖醇添加量为2.6%；羧甲基纤维素钠添加量为0.03%；六偏磷酸钠添加量为0.03%，以感官评分为标准，设置柠檬酸和D-异抗坏血酸钠（质量比1∶0.4）添加量为0.15%、0.20%、0.25%、0.30% 和0.35%，得出最优柠檬酸和D-异抗坏血酸钠添加量范围。

1.5 响应面优化试验

在单因素试验结果的基础上，以羧甲基纤维素钠和六偏磷酸钠添加量（A）、北虫草粉添加量（B）、麦芽糖醇和木糖醇添加量（C）、柠檬酸和D-异抗坏血酸钠添加量（D）为4 个考察因素，以感官评分为响应值，通过Design Expert 13.1.0 设计响应面试验，试验因素与水平见表2。

表2 响应面试验因素水平设计Table 2 Factors and levels of response surface methodology

1.6 北虫草饮品指标的测定

北虫草饮品的酸价参考林杨斌[13]的方法测定；过氧化值参考高牡丹等[14]的方法测定；菌落总数、大肠杆菌数、霉菌和酵母数参考刘凤会[15]的方法测定；氨基酸通过刘芳等[16]的方法测定；酸度依据邢常辉等[17]的方法测定；甜度采用贺璇等[18]的方法测定。

1.7 数据处理

每组试验重复测定3 次。试验采用Microsoft Office Excel 2016 和SPSS 22.0 进行数据统计和计算；采用SIMCA 13.0 软件进行PLS-DA 模型构建与差异化分析；采用Origin 2021 软件进行绘图，采用Design Expert 13.1.0 软件对北虫草饮品进行响应面试验及模型构建。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 羧甲基纤维素钠和六偏磷酸钠添加量的确定

羧甲基纤维素钠和六偏磷酸钠（1∶1）添加量对北虫草饮品的甜度、酸度、感官评分的影响见图1。

图1 羧甲基纤维素钠和六偏磷酸钠添加量对饮品的影响Fig.1 Effect of adding sodium carboxymethyl cellulose and sodium hexametaphosphate on beverages

由图1 可知，羧甲基纤维素钠和六偏磷酸钠添加量为0.04%时，北虫草饮品的感官评分最高，在此条件下饮品清澈、无杂质、口感柔和。当羧甲基纤维素钠和六偏磷酸钠添加量高于0.04%时，随着羧甲基纤维素钠和六偏磷酸钠添加量的增加，北虫草饮品会有苦味产生。羧甲基纤维素钠和六偏磷酸钠添加量过低时（0.01%～0.03%），北虫草饮品口感有颗粒感且伴随杂质产生。因此，选取羧甲基纤维素钠和六偏磷酸钠添加量为0.03%、0.04%和0.05%进行后续响应面试验。

2.1.2 北虫草粉添加量的确定

北虫草粉添加量对北虫草饮品的甜度、酸度、感官评分的影响见图2。

图2 北虫草粉添加量对饮品的影响Fig.2 Effect of adding amount of Cordyceps militaris powder on beverages

由图2 可知，当北虫草粉添加量为9%时，北虫草饮品的感官评分最高，此时的北虫草饮品光度饱满且清晰可见，颜色呈橘色略带红，口感香甜。当北虫草粉添加量低于9%时，北虫草饮品的口感有粗粒感，当北虫草粉添加量高于9% 时，北虫草饮品颜色偏白。因此，选取北虫草粉料液比为7%、9%、11% 进行后续响应面试验。

2.1.3 麦芽糖醇和木糖醇添加量的确定

麦芽糖醇和木糖醇（1∶1.3）添加量对北虫草饮品的甜度、酸度、感官评分的影响见图3。

图3 麦芽糖醇和木糖醇添加量对饮品的影响Fig.3 Effect of adding amounts of maltitol and xylitol on beverages

由图3 可知，当麦芽糖醇和木糖醇添加量为6%时，北虫草饮品感官评分最高，在此条件下，北虫草饮品质地均匀，流动性好，黏度适中，无分层现象。当添加量添加量过高时，饮品质地不均匀，流动性差，无黏度，分层明显，而当添加量添加量过低时，北虫草饮品有苦味、香味不纯。因此，选取麦芽糖醇和木糖醇添加量为5%、6%和7%进行后续响应面试验。

2.1.4 柠檬酸和D-异抗坏血酸钠添加量的确定

柠檬酸和D-异抗坏血酸钠（1∶0.4）添加量对北虫草饮品的甜度、酸度、感官评分的影响见图4。

图4 柠檬酸和D-异抗坏血酸钠添加量对饮品的影响Fig.4 Effect of citric acid and sodium D-isoascorbate addition on beverages

由图4 可知，柠檬酸和D-异抗坏血钠的添加量到达0.25%时，北虫草饮品的感官评分最高，在此条件下饮品呈浅黄色稍偏红，无杂质、无分层现象，色泽均匀。当柠檬酸和D-异抗坏血酸钠添加量高于0.25%时，北虫草饮品有杂质产生；柠檬酸和D-异抗坏血酸钠添加量低于0.25%时，饮品质地不均匀，流动性差，无黏度，分层明显。因此，选取柠檬酸和D-异抗坏血钠添加量为0.20%、0.25%和0.30%进行后续响应面试验。

2.2 响应面试验结果

在单因素试验基础上，以A羧甲基纤维素钠和六偏磷酸钠添加量、B北虫草粉添加量、C麦芽糖醇和木糖醇添加量、D柠檬酸和D-异抗坏血酸钠添加量为自变量，以北虫草饮品的感官评分Y作为衡量标准，进行响应面试验，响应面试验设计及结果见表3。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Design and result of response surface methodology

通过Design Expert 13.1.0 构建Box-Behnken 多元回归模型，感官评分为响应值，拟合公式为Y=90.58+0.70A+2.00B-1.34C-0.31D-1.13AB-1.02AC-2.50AD-0.98BC+2.05BD+3.13CD-4.47A2-6.25B2-6.41C2-5.56D2。

拟合回归方程结果分析见表4。

表4 拟合回归方程结果分析Table 4 Result of fitting regression equation

由表4 可知，响应面模型的F值为41.06，P值小于0.000 1，说明响应面试验的模型构建极为显著，通过比较数据中各方差来源的F值可以得出，各因素对北虫草饮品的感官评分影响由小到大顺序为D＜A＜C＜B。失拟项F值为4.74、P值为0.073 5，说明响应面模型具有较高可靠性，响应面模型与纯误差二者之间关联并不显著，交互项BD、CD与二次项A2、B2、C2、D2均对北虫草饮品感官评分产生极显著影响，决定系数R2为0.976 2，校正系数R2Adj与预测系数R2pred差值＜0.2，说明试验数据与真实数据有较高拟合度，也说明了试验有97.62%符合数据模型。

两两因素交互作用对北虫草饮品感官评价的影响见图5。

图5 两两因素交互作用对北虫草饮品感官评分的影响Fig.5 Effect of two-factor interaction on sensory evaluation of Cordyceps militaris drink

响应面与等高线图可以表征各因素之间的交互作用，椭圆形等高线表示两因素之间的交互作用明显，圆形则表示两因素之间的交互作用不明显[20-21]。由图5可知，AC、AD、BC之间的响应面较为平缓，说明它们的交互作用对北虫草饮品感官评分影响不显著，拟合回归方程结果分析与响应面所反映的各因素之间的交互作用结果一致。

2.3 验证试验

根据响应面试验，得到北虫草饮品最佳配方为羧甲基纤维素钠和六偏磷酸钠添加量为0.04%，北虫草粉添加量为9%，麦芽糖醇和木糖醇添加量为6%，柠檬酸和D-异抗坏血酸钠添加量为0.25%，此时感官评分为91.4。基于软件分析与实际工艺的可行性，以羧甲基纤维素钠和六偏磷酸钠添加量为0.04%，北虫草粉添加量为9.5%，麦芽糖醇和木糖醇添加量为6.4%，柠檬酸和D-异抗坏血酸钠添加量为0.25%为条件，进行3 次重复试验，得出感官评分为91.5，与预测结果相近，证实基于该响应面模型分析优化北虫草饮品工艺的方法有效可行。

2.4 品质分析

根据感官评分标准，以羧甲基纤维素钠和六偏磷酸钠添加量为0.04%，北虫草粉添加量为9.5%，麦芽糖醇和木糖醇添加量为6.4%，柠檬酸和D-异抗坏血酸钠添加量为0.25% 为配方，制作北虫草饮品并依据GB 7101—2015《食品安全国家标准饮料》进行分析，通过4 次平行试验验证，北虫草饮品酵母≤8 CFU/g；酸价≤3 mg/g；过氧化值≤0.16；菌落总数≤18 CFU/g；大肠杆菌数≤1 CFU/g；霉菌数≤9 CFU/g，各项理化指标与微生物指标均符合国家安全质量标准的各项规定。

2.5 北虫草饮品品质成分的PLS-DA 分析

北虫草饮品品质成分的PLS-DA 得分图、交叉验证结果图、变量投影重要值（variable important in projection，VIP）条形图见图6。

图6 北虫草饮品品质成分分析Fig.6 Analysis of quality components of Cordyceps militaris beverages

由图6（a）可知，为获得北虫草饮品差异化合物，通过PLS-DA 分析北虫草粉含量与饮品品质成分间的关系，旨在获取对北虫草饮品品质贡献率较大的差异性化合物。其中最优配方羧甲基纤维素钠和六偏磷酸钠添加量为0.04%，北虫草粉添加量为9.5%，麦芽糖醇和木糖醇添加量为6.4%，柠檬酸和D-异抗坏血酸钠添加量为0.25%。累计方差贡献率=1.902＞0.8，其中自变量拟合指数R2X=0.907，因变量拟合指数R2Y=0.995，表明模型数据能够解释95% 的自变量与92%的因变量。由图6（b）可知，交叉验证次数为200 次，模型预测指数Q2=0.962，说明模型对北虫草饮品的预测能力达到96.2%。VIP 值表示变量对模型的贡献率，值越大贡献越大[22]。由图6（c）可知，虫草素、苏氨酸、甲硫氨酸等品质指标对北虫草饮品的品质差异贡献较大，通过控制差异性物质进行北虫草饮品研制，对北虫草饮品加工应用具有重要的现实意义。

3 结论

由拟合回归方程结果分析可知，对北虫草饮品感官评分的影响由小到大分别为柠檬酸和D-异抗坏血酸钠添加量＜羧甲基纤维素钠和六偏磷酸钠添加量＜麦芽糖醇和木糖醇添加量＜北虫草粉添加量。北虫草饮品的最佳配方为羧甲基纤维素钠和六偏磷酸钠添加量为0.04%，北虫草粉添加量为9.5%，麦芽糖醇和木糖醇添加量为6.4%，柠檬酸和D-异抗坏血酸钠添加量为0.25%。在此配方下制得的饮品感官评分为91.5，各项理化性质均符合饮品的质量和卫生指标，北虫草饮品的差异性化合物主要有虫草素、苏氨酸、甲硫氨酸。北虫草的利用目前主要集中在北虫草茶、虫草汤、虫草酒等，利用其生产饮品的研究为北虫草的深加工提供新的理论依据，也为北虫草产业多样性开发提供参考依据，北虫草饮品具有广阔市场前景。