非编码RNA 对牛前体脂肪细胞分化的研究进展

何瑞莹，吴章情，昝林森，张涛平，马伟东，杨武才*

（1.西北农林科技大学动物科技学院国家肉牛改良中心，陕西杨凌 712100；2.陕西秦宝牧业股份有限公司，陕西杨凌 712100；3.陕西省良种农牧场，陕西宝鸡 722200）

随着经济社会的发展，人民生活水平逐渐提升，高端牛肉市场迅速扩大，产品供不应求。目前，我国高端牛肉主要依赖于进口，国产高档牛肉生产比例不足5%，高端牛肉生产是我国牛肉产业的突出弱点。脂肪作为储存能量的重要器官，与牛肉品质密切相关，特别是肌内脂肪含量是评价牛肉等级的重要指标，而脂肪沉积在一定程度由前体脂肪细胞的增殖分化决定[1]。

前体脂肪细胞来源于骨髓中的间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）[2]，是脂肪组织的基本生物学单位，MSCs 在细胞因子、信号通路、激素、诱导因素（胰岛素等）及分化因子的刺激和调控下，定向分化为前体脂肪细胞[3]。近年来，研究发现脂质沉积是通过调节前体脂肪细胞分化过程中的甘油三酯相关合成酶来实现的，越来越多的功能基因和代谢途径被鉴定参与了前体脂肪细胞分化，如脂肪细胞中的特异性调控因子PPARγ、C/EBPα、FABP4 和SREBP-1 以及PPAR 信号通路、mTOR 通路、MAPK 通路和Wnt 通路等[4]。

非编码RNA（Non-coding RNA，ncRNA）是一类不编码蛋白质的表观遗传学调节因子，根据核苷酸序列长短可分为短链非编码RNA（Small non-coding RNA,sncRNA）和长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA），sncRNA 是长度＜200nt 的ncRNA，如微小RNA（MicroRNA，miRNA）、小干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）、核小RNA（Small nuclear RNA，snRNA）等；lncRNA 是长度＞200nt 的ncRNA；另外还有一种结构特殊的ncRNA——环状RNA（Circular RNA，circRNA）[5]。随着分子生物学及高通量测序技术的快速发展，ncRNA 在细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程中发挥的重要调控作用被进一步揭示，已有研究发现ncRNA 在前体脂肪细胞分化过程中发挥重要功能。有研究表明，miRNA 通过靶向基因影响靶mRNA 的稳定性或翻译过程，从而调控牛前体脂肪细胞分化；lncRNA 作为调控元件或者竞争性内源RNA（Competing endogenous RNA，ceRNA）影响前体脂肪细胞分化；circRNA 作为ceRNA 海绵吸附miRNA，从而削弱miRNA 对靶基因的抑制作用，进而调控牛前体脂肪细胞分化[6]。

目前，对前体脂肪细胞分化机制研究主要集中在脂质合成相关通路和编码基因的表达水平上，而关于ncRNA 调控前体脂肪细胞分化的研究较少。因此，本文主要就ncRNA 调控牛前体脂肪细胞分化相关研究进行综述，以期为研究ncRNA 调控牛前体脂肪细胞分化的分子机制提供理论参考。

1 m iRNA 调控牛前体脂肪细胞分化

miRNA 是长度为19～25 个核苷酸的内源性单链非编码RNA，在物种之间具有强烈的功能保守性，是第1 个被鉴定和表征的非编码RNA[7]。当miRNA 和mRNA 完全互补时，miRNA 可通过形成沉默复合体（miRNA-containing RNA induced silencing coplex，miRISC），将靶mRNA 特异降解；当miRNA 和mRNA 不完全互补，仅在某些位点结合时，那么靶mRNA 不会被特异降解，而是抑制mRNA 翻译过程，使其不能合成蛋白质，从而发挥作用[8]。

1.1 差异miRNA 的鉴定

研究发现，不同牛品种间脂肪组织、肌肉组织及不同部位脂肪组织间存在miRNA 差异表达。Li 等[9]对新疆褐牛与哈萨克牛背最长肌进行差异分析，鉴定出346 个差异表达的miRNA；Jin 等[10]在极低和极高背膘厚牛的皮下脂肪组织中鉴定到15个显著差异表达的miRNA，其中7 个miRNAs 在高背膘厚牛的皮下脂肪组织中高表达，8 个miRNAs 在低背膘厚牛的皮下脂肪组织中高表达；汪海洋等[11]在西门塔尔牛皮下脂肪和肌内脂肪中鉴定到88 个显著差异表达miRNA；Zhang 等[12]在秦川阉牛和公牛肌内脂肪中鉴定到52 个差异表达miRNA，KEGG 通路富集分析表明其通过脂质代谢和脂肪细胞分化相关通路发挥作用。此外，在脂肪细胞分化不同时期，miRNA 也存在显著的差异。Yang 等[13]选取不同分化阶段的秦川牛肌内前体脂肪细胞进行转录组测序，鉴定到77 个与分化期差异表达miRNA；Yu 等[14]在西门塔尔牛前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞中鉴定到250 个差异表达的miRNA，其中131 个miRNA 在脂肪细胞中高表达，119 个miRNA 在前体脂肪细胞中高表达。以上结果表明，miRNA 可能在前体脂肪细胞分化过程中发挥重要调控作用。

1.2 miRNA 与脂肪分化

在转录组测序基础之上，目前开展了大量的miRNA 功能研究。有研究发现，miR-130a/b、miR-149-5p、miR-224、miR-15a 等miRNA 可通过下调脂肪细胞分化相关基因的表达抑制前体脂肪细胞分化；而miR-1271、miR-378、miR-381、miR-302b 等miRNAs 通过上调脂肪细胞分化相关基因的表达促进前体脂肪细胞分化（详见表1）。除此之外，miRNA 可靶向特定基因调控相关信号通路来发挥作用，AKT1 是位于mTOR 通路下游调节脂肪沉积的重要蛋白质。Chen 等[15]发现bta-miR-150 靶向AKT1 基因，通过miRISC 特异的降解AKT1 的mRNA 调控mTOR 通路，从而抑制秦川肉牛前体脂肪细胞分化。Zhang 等[16]发现miR-33a 可直接靶向胰岛素受体底物2（IRS2），通过IRS2-Akt 途径抑制牛前体脂肪细胞的分化。上述研究揭示了miRNA 在脂肪组织及不同分化阶段脂肪细胞中的表达谱，数十个miRNAs 被证明影响脂肪细胞分化，但目前关于miRNA 与lncRNA 和circRNA 等ncRNAs 相互调控研究较少。

表1 非编码RNA 在脂肪发育中的功能

2 lncRNA 调控牛前体脂肪细胞分化

长链非编码RNA（lncRNA）是一类从基因组转录而来的ncRNA，保守性较低，长度超过200nt[16,17]。lncRNAs 通常根据其相对于蛋白质编码基因的转录位点进行分类，有增强子lncRNAs、启动子lncRNAs、反义lncRNAs（从蛋白质编码基因以反义方向转录）、基因间lncRNAs，以及内含子和/ 或外显子产生的环状lncRNAs[18]。lncRNAs 可以通过染色体重塑和变构调节参与转录前调控；通过启动子或转录因子影响转录水平；通过mRNA 成熟、转运、蛋白质合成等过程参与转录后调控，从而影响细胞分化、发育、免疫反应和肿瘤发生等生物学过程[19]。

2.1 差异lncRNA 的鉴定

近年来通过转录组测序，在不同品种、组织、年龄及脂肪细胞分化阶段中鉴定了大量差异表达的lncRNAs。Liu 等[20]在山东黑牛和鲁西牛的背最长肌中鉴定出480 个差异表达的lncRNA。Choi 等[21]从Hanwoo 牛骨骼肌和3 种脂肪组织（肌内、皮下和网膜）中鉴定出了76 个组织特异性的lncRNA。不同年龄阶段的牦牛组织中lncRNAs 存在显著差异，0.5 岁和2.5 岁牦牛在肌肉组织中差异表达4 个lncRNA 和223 个circRNA，而在脂肪组织中差异表达9 个lncRNA[22]。不同生长阶段的秦川牛脂肪组织中有119 个差异表达的lncRNA[23]。研究lncRNA 在牛脂肪组织的表达谱，可以进一步理解lncRNA 对脂肪生成功能的调控机制。

2.2 lncRNA 与脂肪分化

目前有研究表明，lncRNA 可以作为“分子海绵”，竞争性结合miRNA，从而发挥作用[24]。Ran 等[25]发现lncFAM200B 的可靶向bta-miR-6529a 负向调控牦牛前体脂肪细胞的增殖和分化，同时lncRNA-420 可作为竞争性内源RNA（ceRNA）结合miR-129-5p，特异性调节DLK1 基因从而抑制牛前体脂肪细胞分化进而影响脂质代谢[26]。ADNCR 是一种新发现的lncRNA，可通过靶向miR-204 发挥作用，在mRNA 和蛋白质水平上显著调节牛前体脂肪细胞中靶向SIRT1 基因的表达，从而抑制脂肪生成[27]。而lnc MIR221HG 可能通过调节miR-221 的表达来抑制脂肪细胞分化[28]。

此外，lncRNA 也可通过顺式作用元件或者反式作用元件调控牛脂肪的生成。lnc SLC30A9通过抑制AKT 蛋白的表达来抑制增殖，并通过将FOS 蛋白募集到过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）的启动子来促进脂肪细胞的分化[29]。lnc BNIP3 可以通过调节细胞周期、DNA 复制途径和直接调节CDC6 表达来抑制牛肌内前体脂肪细胞增殖[30]。lncRNA BADLNCR1 与GLRX5 基因的启动子结合从而抑制基因的转录活性和mRNA 的表达，进而抑制牛的成脂分化[30,31]。而过表达lnc210 可上调水牛肌内脂肪细胞中过氧化物酶体增殖物从而激活PPARγ 和CCAAT 增强子结合蛋白α（C/EBPα）的mRNA 表达来促进脂质积累[32]。

目前，关于lncRNA 调控脂肪生成的研究在小鼠和人类中较多，在牛脂肪沉积方面的研究还处于起步阶段，许多lncRNA 的调控机制仍有待发现。

3 circRNA 调控牛前体脂肪细胞分化

环状RNA 是通过在真核细胞中对基因外显子的前RNA 进行反向剪接而产生的，具有共价键合的闭环结构，不易被核酸外切酶RNase 降解，因此稳定性比线性RNA 更强[33]。与mRNA和lncRNA 不同，circRNA 不含poly A 尾，因此circRNA 主要富集在没有poly A 尾巴的RNA 中。有研究发现circRNAs 主要有4 种功能：一是circRNA 与蛋白质结合形成作用于靶基因的RNA-蛋白质复合物。例如，circ-FOXO3 可以与细胞周期依赖性激酶2（Cycle dependent kinase 2，CDK2）和P21 结合形成circ-FOOO3-CDK2-P21三元复合物，进而抑制细胞周期[34]。二是circRNA 可以用作miRNA 海绵，与细胞质中的mRNA竞争与miRNA 结合，从而调节基因表达。三是circRNA 可以编码蛋白质，circ-ZNF609 翻译产生参与肌肉生长和发育的蛋白质[35]。四是circRNAs可以调节基因转录[36]，如circFUT10 和一些肌肉衍生的分化因子共同调节骨骼肌的生长发育[37]。

3.1 差异circRNA 的鉴定

随着RNA 测序（RNA-Seq）和生物信息学技术的发展，研究牛转录组差异基因与特定性状之间的关系已成为目前的研究热点。Reyhan 等[38]整合了5 个肉牛品种（安格斯牛、中国西门塔尔牛、鹿西牛、南洋牛和山东黑牛）的差异表达分析转录组图谱，鉴定了34 个参与脂质代谢的circRNAs。Yang 等[39]比较了雷琼牛和陆丰牛这两种类型的中国南方牛背最长肌中的circRNA 转录物，鉴定出3330 个差异表达的circRNA，并分析了circRNA 相关的ceRNA 网络。有学者在牦牛脂肪细胞分化过程中鉴定了circRNA 的表达模式，发现脂肪细胞分化后的第2 天有7 个circRNA 差异表达，第12 天有136 个circRNA 差异表达[40]。Zhao 等[41]使用RNA-Seq 技术从牛脂肪细胞中筛选了调节ACSL1 基因和其他UFA 合成相关基因的39 个circRNA，进一步了解了牛脂肪细胞中PUFA 合成的分子调节机制。综上，不同牛品种间脂肪组织、肌肉组织及不同部位脂肪组织间均存在circRNA 差异表达，即circRNA 在牛脂肪细胞分化中发挥着重要作用。

3.2 circRNA 与脂肪分化

目前对circRNA 的研究主要集中在竞争性内源RNA（ceRNA）网络的调节作用上[42]。circBDP1 通过启动靶向Sirt1/TRARG1 的miR-181b/miR-204 来调节牛的脂肪发育[43]。而circBTBD7主要位于细胞质中，作为竞争性内源RNA（ceRNA）通过circBTBD7/miR-183/SMAD4 轴抑制PPARγ 的表达[44]。研究发现circUBE2Q2 在肉质相关肌肉、脂肪组织和细胞中含量丰富，其表达在MuSCs 成肌分化和SVFs 成脂分化过程中显著上调，同时circUBE2Q2 可以作为miR-133a 的海绵来调节MuSC 的分化[45]。circFUT10 与海绵分子let-7c 结合并通过靶向牛脂肪细胞中的PPARG C1B 来促进细胞增殖并抑制细胞分化[46]。研究发现circDAMTS16 靶向miR-10167-3p 抑制牛脂肪细胞分化并促进其增殖[47]。也有研究表明circRNF111 与脂肪细胞分化呈正相关并作为miR-27a-3p 海绵发挥作用，消除miR-27a-2p 对PPARγ 基因的抑制作用，从而促进脂肪生成[48]。

circRNA 通过ceRNA 机制调节牛脂肪和肌肉细胞的增殖和分化，并在调节脂肪沉积和肌肉生长发育中发挥重要作用[49]。但仍然需要进一步的研究来鉴定不同circRNAs 亚型的差异表达，以及不同的circRNA 亚型是否具有不同的功能。

4 小结

脂肪沉积的分子调控机制错综复杂，涉及多种调节因子和信号通路。现有研究表明，ncRNAs作为基因表达的调节因子在脂肪生成和发育中发挥着至关重要作用。随着科技不断进步，分子生物学技术、单细胞和空间多组学、高分辨率显微镜、单分子分析方法等研究手段可以更准确地揭示更多关于ncRNAs 的功能信息。现有关于ncRNA 调节脂肪生成的研究大部分集中在单个ncRNA 对脂肪细胞分化的影响，其更深层次的作用机制仍然不够明确。此外，还应考虑ncRNAs 之间的互作网络：lncRNA 可以吸收miRNA 来调节靶基因的表达，同样，circRNA 也可以直接吸附miRNA 来缓解对基因的抑制作用。lncRNA、miRNA 和circRNA 的相互作用网络是细胞中潜在的关键调节机制，可能对脂肪生成产生相当大的影响。因此，以ncRNAs 为中心的脂肪调节网络仍需进一步深入研究。随着研究手段不断进步和牛ncRNAs 数据库的不断完善，加上ncRNAs分子功能与调节机制的研究进展不断加快，以ncRNA 为切入点研究肉牛脂肪沉积的研究成果会越来越多，这将为牛肉肉质性状改善和新品种选育改良提供理论支持。