对氯间甲酚及复方对氯间甲酚对鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊的抑杀效果

何学柏 迟依明 梁圣杰 李澍 杜孟泽 李秋明

摘 要 为验证苯酚类消毒剂对鸡球虫卵囊的抑杀作用，采用不同浓度的单体和复方对氯间甲酚消毒剂与未孢子化的柔嫩艾美耳球虫卵囊共孵育，检测其对卵囊孢子化率的影响；与孢子囊共同孵育，通过子孢子脱囊率评价其对子孢子释放的干扰。孢子化卵囊经过不同浓度消毒剂直接浸泡、粪便干扰下浸泡或喷雾处理后经口接种雏鸡，通过OPG和盲肠病变记分探究消毒剂处理对卵囊的繁殖力和鸡的致病性的影响。结果显示， 2种消毒剂均可使孢子化率和子孢子脱囊率显著下降，且3种浓度的复方对氯间甲酚与3%氨水对照组（PC）的消毒效果无显著差异。直接浸泡处理试验结果显示，2%和3%复方对氯间甲酚 （HTS2和HTS3）具有更为显著的抑杀效果，与PC无显著差异；粪便干扰试验结果显示，粪便作用下这两种消毒剂对球虫卵囊仍有理想的抑杀效果；喷雾处理试验结果显示，3%对氯间甲酚（HT3）对球虫卵囊抑杀效果最好，显著优于PC组（P＜0.05），而2%对氯间甲酚（HT2）、HTS2和HTS3组的抑杀效果与PC组无显著差异。研究结果表明，不同浓度下这2种消毒剂对孢子化和未孢子化的柔嫩艾美耳球虫卵囊都有一定的抑杀作用，综合比较，复方对氯间甲酚消毒剂具有更强的抑杀球虫卵囊效果，具有代替氨水成为鸡球虫消毒剂的潜能。

关键词 对氯间甲酚；柔嫩艾美耳球虫；OPG；卵囊孢子化率；子孢子脱囊率

球虫病是目前养禽业常见的、危害严重的传染性寄生虫病，可以造成巨大的经济损失［1］。据估计，2016年全球因鸡球虫病造成的经济损失超过了10.4亿英镑，其主要包括治疗、死亡和控制成本［2］。一直以来，控制该疾病的策略包括疫苗接种和药物预防，虽然疫苗和药物在控制球虫病方面发挥了巨大作用，然而，持续使用不同的抗球虫药已导致球虫产生抗药性［3］，且中国已禁止在饲料中添加抗生素类药物；另外，由于传统疫苗的局限性，至今仍未在中国小日龄出栏肉鸡中广泛使用，这为防治球虫病带来了很大困难［4］。若能筛选或开发一种有效的球虫卵囊消毒剂，对禽舍进行有效的环境消毒，将是一种防控球虫病的有效举措。然而，目前关于球虫卵囊消毒剂的研究资料十分有限，尚未见有一种临床上可直接用于鸡球虫卵囊消毒的消毒剂［5］。为了寻找廉价、高效和刺激性小的鸡球虫卵囊消毒药，本试验对候选的酚类消毒剂进行体内体外测试，探究以对氯间甲酚为主要成分的消毒剂对柔嫩艾美耳球虫卵囊的孢子化率、孢子化卵囊的脱囊率，以及在鸡体内的繁殖力和致病力的影响，以期为防控球虫病积累相关的数据经验。

1 材料与方法

1.1 试验耗材

对氯间甲酚消毒剂（含对氯间甲酚100 g/L，CAS编号59-50-7）、复方对氯间甲酚消毒剂（含对氯间甲酚100 g/L，CAS编号59-50-7；含苄氯酚50 g/L ，CAS编号59-50-7）均购自比利时浩卫制药股份有限公司；氨水、甲醛、重铬酸钾和氯化钠均采自国药集团化学试剂有限公司；生理盐水购于北京索莱宝科技有限公司。

1.2 球虫卵囊与实验动物

柔嫩艾美耳球虫亲本株由北京农学院球虫实验室从河南某鸡场分离、纯化和保存。经14日龄海兰公雏鸡传代、复壮后，收集盲肠组织未孢子化的卵囊，一部分用于研究消毒剂对柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化的影响；一部分置于2.5%重铬酸钾中，于28 ℃恒温摇床震荡培养48 h，至孢子化率达到80%以上，保存于4 ℃冰箱。1日龄海兰公雏鸡购自北京市华都峪口禽业有限责任公司，于无球虫环境饲养至14日龄。

1.3 试验设计

每个试验均分为8个处理组，即0.9%生理盐水对照组（NC）、1%对氯间甲酚组（HT1）、2%对氯间甲酚组（HT2）、3%对氯间甲酚组（HT3）、1%复方对氯间甲酚组（HTS1）、2%复方对氯间甲酚组（HTS2）、3%复方对氯间甲酚组（HTS3）、3%氨水对照组（PC）。

1.4 消毒剂对柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化的影响

将1×105个新鲜未孢子化的球虫卵囊分别与10 mL处理液在15 mL离心管中混悬处理18 h，每组3个重复。处理后用蒸馏水离心冲洗以除去残余处理液。而后将离心沉淀的卵囊加入  2.5%重铬酸钾溶液中，于28 ℃恒温摇床内孢子化48 h。显微镜下观察100个以上的卵囊，计算出孢子化率，用于评价不同消毒剂对新鲜卵囊孢子化的抑制效果。

孢子化率=孢子化卵囊数/（孢子化卵囊數+未孢子化卵囊数）×100%

1.5 消毒剂对柔嫩艾美耳球虫子孢子脱囊逸出的影响

将1×105个已孢子化的球虫卵囊分别与各处理液混合，处理方式同“1.4”。将离心沉淀后的卵囊加入200 μL PBS缓冲液重悬，再加入50个直径1 mm的玻璃珠，使用涡旋振荡器震荡，显微镜下观察并计算卵囊的破壁率，至卵囊破壁率达到70%以上停止震荡。将破壁后的球虫卵囊加入胆酸盐消化液中（将0.75% 胰蛋白酶和10% 鸡胆汁加入配置好的 PBS中，混匀），37 ℃孵育40 min。孵育完成后在显微镜下计算子孢子的脱囊数量，同时也记录视野中的孢子囊数量，最后计算子孢子的脱囊率［6］。

子孢子脱囊率=子孢子数/（子孢子数+孢子囊数×2）×100%

1.6 消毒剂对柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊的抑杀效果

将已孢子化的球虫卵囊分别与各处理液混合，处理方式同“1.4”。将处理好后的卵囊经口接种14日龄的雏鸡，每组6只，每只接种1×104个卵囊。感染后观察血便状态。接种第6 天清理粪便，收集第7、8 天的粪便，按照麦克马斯特计数法［7］（McMasters method）计算OPG值，每一组取粪便样品5份，每份计数2次后求平均值。第8 天剖杀所有试验鸡，进行盲肠病变记分并拍照［8］。通过OPG值和盲肠病变记分评价不同消毒剂对孢子化卵囊的感染活性抑杀效果。

1.7 消毒剂在鸡粪便的影响下对柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊的抑杀效果

将1×105个已孢子化的球虫卵囊与3 g研磨成粉的鸡粪便混匀，分别加入10 mL各处理液搅拌均匀处理18 h，用蒸馏水离心冲洗除去残余处理液，经口接种14日龄的雏鸡，每组6只，每只鸡接种1×104个卵囊。检测指标同“1.6”。

1.8 消毒剂对附着在固体表面上球虫的抑杀效果

使用消毒剂喷雾对附着在平皿表面的球虫卵囊进行消毒效果评价，以模拟鸡舍消毒场景。室温条件下，每组取1×105个已孢子化的球虫卵囊平铺于塑料培养皿（直径=8.5 cm）中，自然风干后，分别用各处理液喷雾6次，一共喷洒液体约0.85 g，且每次喷出的液体质量为 （0.14±0.02）g。處理液作用1 h后用蒸馏水冲洗平皿，收集其中的卵囊，经过离心沉淀后将卵囊最终加入2 mL清水混匀，经口接种14日龄雏鸡，每组5只，每只鸡接种1×104个卵囊。检测指标同“1.6”。

1.9 数据处理与分析

采用Excel 2019软件绘图以及使用SPSS 21软件进行统计学分析处理。对于符合正态分布的两组数据，方差不齐时使用带有Welchs校正的非配对t检验进行分析，方差等齐时使用非配对t检验。当两组数据不服从正态分布时，使用Mann-Whitney秩和检验。当需要多组比较时，如果数据符合正态分布则使用ANOVA检验，不符合正态分布时使用Kruskal-Wallis检验。当  P＜0.05时认为数据“平均数±标准差”具有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 不同消毒剂对柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化的影响

与NC组相比，不同浓度下2种消毒剂对柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化都有较强的抑制作用（P＜0.001）。其中HTS3组孢子化率最低，接近氨水对照组，并且两者无显著差异（P＞0.05，图1）。表明3%复方对氯间甲酚对球虫卵囊孢子化的抑制效果最好。

与NC组相比，***表示具有极其显著的统计学差异（P＜0.001）；与PC组相比，ns表示无显著差异（P＞0.05）。下同

2.2 不同消毒剂对球虫卵囊子孢子逸出的影响

为检测不同浓度下2种消毒剂对孢子化卵囊的感染是否也有抑杀效果，使用不同浓度的消毒剂与孢子囊孵育，观察其对子孢子释放的干扰。结果显示（图2），与NC对照组相比，HT2、HT3、HTS1、HTS2和HTS3组在一定程度上抑制鸡柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊的脱囊（P＜0.001），其中HTS1、HTS2、HTS3这3个处理组子孢子脱囊率与氨水对照组相比无显著差异。表明同等浓度下，复方对氯间甲酚对孢子化卵囊的体外消毒效果要优于对氯间甲酚，且与氨水效果一致（图3）。

2.3 不同消毒剂直接浸泡处理下对球虫卵囊的抑杀效果

雏鸡感染模型试验进一步评价了这2种消毒剂对孢子化卵囊的消毒效果，将不同浓度消毒剂与孢子化的球虫卵囊处理18 h后，经口接种雏鸡。结果显示，与NC组相比，2种消毒剂处理组的OPG值极显著下降（P＜0.001）；与单方相比，HTS2和HTS3组具有更为显著的抑杀效果；与PC组无显著差异。盲肠评分结果与OPG结果相符（表1）。表明直接浸泡处理下2%和3%的复方对氯间甲酚对孢子化球虫卵囊的抑杀效果  显著。

2.4 不同消毒剂在鸡粪便干扰下浸泡处理对球虫卵囊的抑杀效果

粪便干扰试验结果显示，与NC组相比（表2），被消毒剂处理后的所有组OPG值均显著下降，其中HTS2、HTS3组具有较为良好的抑杀效果，与PC组无显著差异（P＞0.05），HTS2、HTS3组盲肠评分较低。试验结果与无鸡粪干扰试验结果趋势一致，表明粪便作用下2%和3%的复方对氯间甲酚对球虫卵囊依然有理想的抑杀  效果。

2.5 不同消毒剂在喷雾处理下对球虫卵囊的抑杀效果

使用消毒剂对附着在平皿表面的球虫卵囊进

行喷雾处理后，与NC组相比（表3），不同浓度下2种消毒剂处理后OPG值均极显著降低（P＜  0.001），其中HTS2组和HTS3组的OPG值与PC组相当，无显著差异（P＞0.05），而HT3组显著低于PC组（P＜0.05）。盲肠病变记分显示HT3、HTS2和HTS3组评分较低，与PC组无显著差异。表明喷雾处理下2种消毒剂都具有较为良好的抑杀效果，其中HTS2组和HTS3组对球虫的抑杀效果与PC组相当，而HT3组抑杀效果优于PC组。

3 讨  论

鸡感染球虫是由于经口吞食了孢子化的球虫卵囊，在体外抑制球虫卵囊的孢子化进程或杀灭孢子化卵囊，可从源头上控制球虫病。本研究检测对氯间甲酚和复方对氯间甲酚2种消毒剂对球虫卵囊的抑杀效果，结果表明，不同浓度下2种消毒剂对孢子化的和未孢子化的柔嫩艾美耳球虫卵囊都有一定的抑杀作用，其中复方对氯间甲酚消毒剂具有较强的抑杀效果，且呈剂量依赖。

鸡球虫的卵囊壁是一个坚固的化学结构，并且能够耐受机械性损伤，卵囊对于化学制品、消化酶、洗涤液以及低渗溶液的破坏具有相当的抵抗力，常规的消毒剂很难破坏球虫的卵囊壁结构［9］。陈汉忠等［10］经试验证实百毒消、七消液和2%的烧碱均对卵囊无效；安健等［11］的试验也说明卵囊对许多消毒剂，如福尔马林、84消毒液、来苏儿等具有较强的抵抗力；近期，郝桂英等［12］发现过氧化氢、碘酊、兽用百毒杀对球虫卵囊孢子化无明显影响； Gadelhaq等［13］发现艾美耳球虫卵囊在使用Dettol、TH4、苯酚、Virkon○[KG-*3/4][HT6”SS]R[HT]后，能够进行正常的孢子化过程以及显示出完整的卵囊壁；韩利方等［5］研究显示，250 mg/L妥曲珠利、3%甲醛、4%苯酚、0.5%过氧乙酸、5%NaOH+10%NaCl和5%NaOH对球虫卵囊活性具有一定的抑制作用，孢子化抑制率超过10%，但是对孢子化卵囊几乎无抑杀作用。目前，经过多人反复研究证实合适浓度的氨水对球虫卵囊具有高效的抑杀作用［5，14-15］，韩利方等［5］研究发现1%～8%的氨水与未孢子化卵囊作用1 h以上，均可100%抑杀球虫卵囊活性；周作勇等［14］发现，7%氨水处理组球虫卵囊的孢子化率仅为2.18%。本试验中3%氨水组作为阳性对照，孢子化率为0.33%，极显著降低卵囊产量和病变记分，这都证实氨水对球虫卵囊发育具有极强的抑杀作用。然而，氨水强烈的刺激性气味使其在密集的养殖方式下使用显然是不适合的［16］。因此，在生产实践中缺少控制球虫的消毒剂。各种酚类消毒剂在日常生活中常被使用，但关于它们抑杀艾美耳球虫卵囊效力的信息十分有限［17］。因此，本研究选用对氯间甲酚和复方对氯间甲酚两种酚类消毒剂对鸡球虫卵囊进行抑杀试验。

有研究报告提出一些针对球虫的消毒策略，这些策略对兽医和人类健康都具有重要意义［18-19］。尽管球虫在禽的流行病学中具有重要意义，但关于使用化学消毒剂降低环境中，特别是在被污染表面上的艾美耳卵囊的活力或传染性的报道有限［20］。球虫卵囊极小， 容易与灰尘一起漂浮在空气中，散布到邻近鸡舍和区域，亦可造成感染［21］。因此，本试验用不同浓度消毒剂对物体表面喷洒消毒模拟现场试验，结果表明不同浓度下2种消毒剂对鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊都具有一定的抑杀效果，其中HT3组抑杀效果最好，优于氨水对照组。本试验中氨水组采用喷洒方式作用鸡球蟲卵囊，与直接浸泡处理相比，粪便卵囊排出量要更高，原因可能是氨水易挥发，不易起到确实的消毒效果。

本试验结果显示，3%复方对氯间甲酚消毒剂既能很好地抑制卵囊孢子化又能抑制子孢子出囊率，表明该消毒剂可控制环境中球虫卵囊孢子化和抑制子孢子脱囊，用该消毒剂对球虫进行物体表面喷洒消毒效果模拟现场试验时，能够减轻肠道病变，减少粪便中卵囊的排出量，表明通过喷雾可削弱球虫的感染能力，进一步说明复方对氯间甲酚消毒剂可作为球虫消毒剂。球虫消毒剂还能与各种抗球虫药联合应用，将环境扑杀与抗球虫药物控制鸡体内球虫卵囊排出的作用结合，减少抗药性的产生，共同防治鸡球虫病。而且球虫消毒剂是外用消毒药，它能减轻球虫药所引起的毒副作用和药物残留，提高经济效益，保证人们的生命健康［22］。这提示复方对氯间甲酚消毒剂在预防和控制鸡球虫病方面有广阔的应用前景。

本研究结果表明，不同浓度下对氯间甲酚和复方对氯间甲酚这2种消毒剂对孢子化的和未孢子化的柔嫩艾美耳球虫卵囊都有一定的抑杀作用，其中复方对氯间甲酚消毒剂具有更强的抑杀效果。

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Inhibitory and Killing Effect  of p-chloro-meta-cresol and p-chloro-meta-cresol Compound on Eimeria tenella Oocysts

Abstract To investigate the inhibitory effect of phenolic disinfectants on chicken coccidial oocysts，different concentrations of monomer or compound formulated p-chloro-m-cresol disinfectants were incubated with un-sporulated Eimeria tenella oocysts in vitro，and their effects on the sporulation rate of oocysts were detected. Besides，the sporozoite oocysts were incubated，and the interference of different disinfectants on the release of sporozoites was evaluated by sporozoite decapsulation rate. And then the sporulated oocysts were treated with three different ways：1） immersion with different concentrations of disinfectants; 2） immersion with feces; 3） spray，and then infect chicks by oral administration. The fecundity and pathogenicity of sporulated oocysts treated with disinfectants were measured by two indicators：oocysts per gram of feces （OPG） and cecal lesion score. The results showed that application of each disinfectant significantly reduced the rate of sporulation as well as release of sporozoites of Eimeria tenella，which had comparable effect with chlorom-cresol and 3% ammonia solution （P＞0.05）. Under the other two different treatments，the fecundity and pathogenicity of Eimeria tenella on chicken  significantly decreased. There was no significant difference between HTS2，HTS3，and the PC group （P＞0.05）.  The spraying treatment showed that 3% para-chloro-m-cresol （HT3） inhibited the killing activity of coccidial oocyst，which was even better than PC （P＜0.05），while 2% para-chloro-m-cresol （HT2），HTS2，and HTS3 had similar inhibitory effect compared with PC，and there was no significant difference （P＞0.05）. This study revealed that these two disinfectants （at different concentrations） have notable inhibitory effects on both sporulated and unsporulated Eimeria tenella oocysts. Generally，the compound formula has better effect than the monomer formular，suggesting that it has potential of compound p-chloro-m-cresol disinfectant on coccidial oocyststo to replace ammonia solution.

Key words p-chloro-meta-cresol；Eimeria tenella；OPG;  Sporulation rates of oocysts；Excystation rate of sporozoites