基于网络药理学与分子对接探讨黄芪-丹参治疗肝纤维化的作用机制

赵一鹏 缪玲 钟亚玩 徐坤敏 黄娜娜 周云松 胡芳

摘要：目的  通过网络药理学与分子对接研究黄芪-丹参治疗肝纤维化作用机制。方法  利用TCMSP数据库平台对黄芪、丹参有效成分及其相关作用靶点进行筛选；利用GeneCards和OMIM数据库平台对肝纤维化作用靶点进行筛选。利用Cytoscape软件构建“药物-成分-疾病-靶点”网络图，运用String和David数据库对靶点进行PPI网络、GO生物过程与KEGG通路分析。通过AutoDock Vina对成分和靶点进行分子对接。结果  黄芪-丹参中共获得有效成分76个，与肝纤维化对应的靶点64个；GO生物过程102条，信号通路155条，主要涉及的信号通路有糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、缺氧诱导因子1（HIF-1）信号通路等。分子对接显示黄芪、丹参中槲皮素、木犀草素、山柰酚和丹参酮ⅡA等与核心靶点AKT1、TP53、VEGFA、TNF、IL-6均具有较好的亲和力。结论  黄芪-丹参治疗肝纤维化的作用机制具有“多成分、多靶點、多信号通路”的特点，为今后的实验研究提供了参考依据。

关键词：黄芪-丹参；肝纤维化；网络药理学；分子对接

中图分类号：R575                                  文献标识码：A                                  DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.04.004

文章编号：1006-1959（2024）04-0021-06

The Mechanism of Huangqi-Danshen in the Treatment of Liver Fibrosis

Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

ZHAO Yi-peng1，MIAO Ling2，ZHONG Ya-wan2，XU Kun-min2，HUANG Na-na2，ZHOU Yun-song2，HU Fang2

（1.The Second Clinical Medical College of Guizhou University of Chinese Medicine，Guiyang 550000，Guizhou，China;

2.Department of Gastroenterology，the Second Affiliated Hospital of Guizhou University of Chinese Medicine，

Guiyang 550000，Guizhou，China）

Abstract：Objective  To study the mechanism of Huangqi-Danshen in the treatment of liver fibrosis by network pharmacology and molecular docking.Methods  The TCMSP database platform was used to screen the effective components and related targets of Huangqi and Danshen. GeneCards and OMIM database platforms were used to screen the targets of liver fibrosis. Cytoscape software was used to construct the "drug-component-disease-target" network diagram， and String and David databases were used to analyze the PPI network， GO biological process and KEGG pathway of the targets. Molecular docking of components and targets was performed by AutoDock Vina.Results  A total of 76 active ingredients and 64 targets corresponding to liver fibrosis were obtained from Huangqi-Danshen. There were 102 GO biological processes and 155 signaling pathways. The main signaling pathways involved were AGE-RAGE signaling pathway， IL-17 signaling pathway， TNF signaling pathway， and hypoxia-inducible factor 1 （HIF-1） signaling pathway in diabetic complications. Molecular docking showed that quercetin， luteolin， kaempferol and tanshinone ⅡA in Radix Astragali and Radix Salviae Miltiorrhizae had good affinity with core targets AKT1， TP53， VEGFA， TNF and IL-6.Conclusion  The mechanism of Huangqi-Danshen in the treatment of liver fibrosis has the characteristics of "multi-component， multi-target and multi-signal pathway"， which provides a reference for future experimental research.

Key words：Huangqi-Danshen;Liver fibrosis;Network pharmacology;Molecular docking

肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是指在各种病因的作用下，肝星状细胞（heapatic stellate cell，HSC）被诱导激活为肌成纤维细胞（myofibroblast，MFP），并且导致肝细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）产生和降解之间的不平衡，导致正常肝功能受损，最后引起肝纤维化[1]。慢性肝炎、脂肪肝以及其他一些肝脏疾病都可发展成为肝硬化甚至肝癌，因此对肝纤维化进行早期诊断与治疗具有很重要意义。最新资料表明[2]，全世界每年约有2百万人死于肝病，其中肝硬化，肝癌为终末期肝病死亡的重要原因；肝硬化致死率由第13位增加到第11位，肝癌致死率由20位增加到16位。由于肝脏疾病具有高复发率、低死亡率等特点，因而越来越引起医学界重視。我国肝病患者约有3千万人，肝硬化在全世界范围内死亡人数为11%[3]；随着社会老龄化程度的增加以及生活方式的改变，我国肝脏疾病发病率呈逐年增长趋势。肝纤维化在各种慢性肝病进展至终末期肝病的进程中起着至关重要的作用，因此早期干预肝纤维化是预防慢性肝病发展为终末期肝病的一种有效手段。近年来中医药抗肝纤维化研究结果备受关注，中药具有多层次、多靶点、多途径的药理作用表现出更大优越性，引起了国内外专家学者的重视[4]。气虚血瘀为肝纤维化的基本病机，因此对肝纤维化治疗以益气活血为主。黄芪、丹参分别为益气，活血之要品，为中医益气活血类常配伍药。本文拟以网络药理学的思想和方法为依托，探讨黄芪-丹参有效成分、作用靶点以及通路间关系，研究黄芪-丹参抗肝纤维化作用机制，以期为肝纤维化临床治疗提供参考依据。

1资料与方法

1.1黄芪-丹参有效成分、靶点筛选  利用中药系统药理学分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database，TCMSP）获取黄芪、丹参有效成分与靶点，以OB≥30%和DL≥0.18为筛选条件，通过UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）对靶点进行标准化处理。

1.2肝纤维化靶点筛选  利用Genecards数据库（http：//www.genecards.org/）、人类孟德尔遗传（OMIM）在线数据库（http：//www.omim.org/），以“hepatic fibrosis”作为检索词，寻找肝纤维化疾病靶点。其中，在GeneCards数据库中以相关性分数≥10为筛选条件。

1.3药物-成分-疾病-靶点网络构建  将药物、有效成分、疾病与作用靶点进行整理，通过Cytoscape（http：//www.cytoscape.org/）构建“药物-成分-疾病-靶点”网络。

1.4 PPI网络构建  在STRING数据库（https：//string-db.org/）中导入黄芪-丹参治疗肝纤维化的作用靶点，以“Homo sapiens”为筛选条件获取核心靶点，通过Cytoscape 3.9.1（http：//www.cytoscape.org/）构建蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络图。

1.5 GO生物过程和KEGG通路富集分析  在David数据库（https：//dvid.ncifcrf.gov/）对共同靶点进行基因本体（gene ontology，GO）生物过程与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析。其中，筛选条件P＜0.05，对P值位于前15的通路进行可视化分析。

1.6分子对接  将PPI网络利用NetworkAnalyzer进行拓扑分析，通过“degree”的方式排序，将基因分值位于前5的靶点选取为受体，将黄芪-丹参核心成分选取为配体，通过AutoDock Vina将受体和配体进行对接，结果以最低结合能进行比较。

2结果

2.1黄芪-丹参有效成分、靶点的筛选  在TCMSP数据库中对黄芪、丹参进行检索，分别获得17个和59个有效成分，共76个有效成分，通过数据库获取作用靶点247个，并通过Uniprot数据库进行标准化处理。

2.2黄芪-丹参治疗肝纤维化的作用靶点  在Genecards数据库和OMIM数据库中分别输入“hepatic fibrosis”进行检索，获得589个疾病靶点。通过Venny2.1软件获得黄芪-丹参有效成分与肝纤维化的共同靶点64个，见图1。

2.3药物-成分-疾病-靶点网络  通过Cytoscape软件构建“药物-成分-疾病-靶点”网络，获得247个药物靶点，589个疾病靶点，64个共同靶点，见图2。结果显示，槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹参酮ⅡA等在网络中起着关键作用，说明这些成分可能是治疗肝纤维化的核心成分。

2.4黄芪-丹参治疗肝纤维化靶点PPI网络  在String数据库中对药物疾病共同靶点进行PPI分析，然后导入Cystoscap，获得PPI网络，涉及64个节点、1167条边，见图3。其中，丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT1）、细胞肿瘤抗原p53（TP53）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素6（IL-6）的度值明显高于其他靶点，说明它们在PPI网络中具有重要作用。

2.5 GO生物过程和KEGG通路富集分析  将药物与疾病64个共同靶点导入David数据库，进行GO生物过程和KEGG通路分析。以P＜0.05为筛选条件，选取P值较小的前15个进行气泡图可视化。获得GO条目102个，主要涉及细胞因子受体结合、细胞因子活性、信号受体激活剂活性、受体配体活性、DNA结合转录因子结合、血红素结合等生物过程，见图4。获得信号通路155条，主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、缺氧诱导因子1（HIF-1）信号通路等，见图5。

2.6分子对接  通过PPI网络，选取度值较大的5个作用靶点和4个有效成分进行分子对接，通过对接分值选择最优构型，见表1。平均对接分值-7.06 kcal/mol，其中，丹参酮ⅡA（tanshinone iia）和TNF对接分值-8.32 kcal/mol，槲皮素（quercetin）和VEGFA对接分值-8.15 kcal/mol，见图6、图7。

3讨论

近年来，随着人类物质文明和生活方式的高度发展，人类的疾病谱已经变的错综复杂，然而这些复杂疾病在发生和发展中常涉及“多脏腑、多靶点、多基因及多信号通路”。网络药理学具有“多靶点、多信号通路”的特点，中药具有多成分、多靶点、多通信号路的作用，与当前的疾病治疗理念相符合，因此研究中药与多成分、多靶点、多通路的相关性，对于阐述疾病发病机制和治疗靶点具有重要价值。

本研究发现槲皮素、木犀草素、山柰酚和丹参酮ⅡA为黄芪-丹参的主要有效成分，可以作用于大量的肝纤维化靶点，它们都属于黄酮类化合物，主要存在于自然界，具有抗炎、抗氧化等作用[5]。蒋炜等[6]研究发现，槲皮素对体外培养的HSC具有明显的调控作用。陈文龙等[7]研究发现，在CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型中，榭皮素具有明显的保护作用。Ma JQ等[8]研究发现，槲皮素能够降低细胞色素P450 2E1和促炎标志物的表达。Cummins CB等[9]研究发现，木犀草素能够诱导HSC凋亡，下调α-平滑肌肌动蛋白表达。Xu T等[10]研究发现，山柰酚可抑制胶原蛋白的合成和HSC的活化。丹参酮ⅡA能够抑制TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4表达，激活Smad7表达，从而抑制HSC的活化[11-13]。以上研究表明，黄芪-丹参的有效成分对肝纤维化的治疗是有效的，具有重要的研究价值。

PPI网络分析中发现，度值比较高的蛋白是AKT1、TP53、VEGFA、TNF、IL-6，说明这些可能为治疗肝纤维化的重要靶点。AKT1属于AKT激酶之一，Akt1可抑制HSC的活化，抑制促肝纤维化标志物的表达[14]。TP53属于肝癌的启动基因，如果伴有乙型肝炎病毒感染，更易发展为肝硬化[15]。VEGFA能够诱导肝脏内的血管新生，以及内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖等[16]。TNF来源于巨噬细胞和免疫细胞，具有调节免疫的能力，不仅是免疫系统主要的调节成分，也是炎症性疾病治疗的主要手段，但如果机体受到感染或组织受到损伤时其又会被激活，诱导和维持炎症的发生[17，18]。此外，TNF具有细胞毒性作用，可诱导肿瘤发生[19]。IL-6是重要的炎症因子，能够诱导肝细胞的炎症反应，导致肝细胞受损以及纤维组织增生，使得慢性炎症持续发展[20]。可见，肝纤维化的发生、发展离不开这些靶点，主要涉及HSC的活化、肝纤维化标志物的表达、血管新生、细胞增殖以及炎症因子表达等。

GO生物过程主要涉及细胞因子受体结合、细胞因子活性、信号受体激活剂活性、受体配体活性、DNA结合转录因子结合等，对于黄芪-丹参治疗肝纤维化具有重要意義。通过KEGG分析发现IL-17信号通路、TNF信号通路和缺氧诱导因子1（HIF-1）信号通路是治疗肝纤维化的特征性信号通路。IL-17在病毒性肝炎、酒精性肝病以及自身免疫性肝炎中呈高表达状态。IL-17A可以通过激活Kupffer细胞与HSC导致IL-6、TNF-α与TGF-β1产生。IL-17还能够通过STAT3诱导 HSC活化增值。在肝纤维化小鼠中，敲除IL-17A与IL-17RA的小鼠，肝纤维化明显减轻[21，22]。TNF-α能够抑制活化的HSC增殖和MMP产生。TNF-α还可以诱导肝内皮细胞和核因子相关细胞因子κB的激活，对肝细胞造成炎性损伤[23]。有文献报道[24]，在各种肝纤维化模型中，HIF-1α的表达均显著高于正常组，且肝纤维化程度越严重，HIF-1α的表达也越高。研究发现[25]，在肝纤维化模型中，通过敲除HIF-1α，VEGF的表达会下降，说明HIF-1α可调控VEGF的表达而导致肝纤维化。

最后，分子对接结果显示，黄芪-丹参主要的有效成分槲皮素、木犀草素和山柰酚与丹参酮ⅡA等与核心靶点AKT1、TP53、VEGFA、TNF、IL-6能够很好地结合，对网络药理学结果的准确性进行了进一步验证。

本研究基于网络药理学和分子对接，初步阐述黄芪-丹参药对治疗肝纤维化可能涉及多成分、多靶点、多信号通路等，丰富了治疗肝纤维化的理论基础，为后续的实验研究提供了参考思路。

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收稿日期：2023-04-13；修回日期：2023-04-25

編辑/王萌