三种方式注射乳腺癌细胞构建的乳腺癌骨转移动物模型对比观察

毛昀，蔡亚芳，褚雪镭，薛鹏，曹文，朱世杰，仇永妹

1 湖南中医药大学第二附属医院肿瘤血液科，长沙 410005；2 北京中医药大学研究生院；3 中国中医科学院望京医院肿瘤科；4 湖南中医药大学第二附属医院互联网医院

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，其病死率居女性癌症首位。骨转移是恶性肿瘤常见并发症，65%～75%的进展期乳腺癌患者可出现骨转移，常发生于脊柱、骨盆和长骨干骺端等部位，伴有病理性骨折、高钙血症、脊髓压迫等骨相关事件［1］。骨转移的治疗策略包括骨保护剂、化疗、放疗、中医药等，虽然能够在一定程度上缓解疼痛、延缓进展，但效果有限。目前对乳腺癌骨转移发生发展的机制尚不明确，寻找早期预防、干预骨转移的潜在靶点和有效药物是骨转移研究领域亟待解决的问题。骨转移动物模型是研究乳腺癌骨转移的基础，建立可重复的、与临床密切相关的动物模型至关重要，亦能评估和检测相关药物的可靠性和安全性［2］。2022 年10 月—2023年9月，我们利用人源性乳腺癌细胞MDA-MB-231-luc和鼠源性乳腺癌细胞4T1-luc分别以左心室注射、胫骨骨髓腔注射、尾动脉注射三种方式构建乳腺癌骨转移小鼠模型，评价造模成功率、肿瘤转移变化过程，寻找最佳造模方式来模拟乳腺癌细胞从原发病灶转移至骨组织的过程，旨在为基础实验选择合理的动物模型提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物及细胞 SPF 级6 周龄BALC/c 裸小鼠24 只，体质量16～18 g；SPF 级6 周龄BALC/c 普通小鼠16 只，体质量18～20 g。实验动物均购自北京维通利华动物技术有限公司，饲养于中日友好医院动物房，温度（25 ± 3）℃，相对湿度55% ± 10%，12 h光暗交替，自由摄食饮水，每周更换2 次垫料，实验操作遵守实验动物福利伦理原则。MDA-MB-231-luc 细胞、4T1-luc 细胞购自国家生物医学实验细胞资源库。

1.1.2 主要试剂与仪器 D-Luciferin 荧光素钠盐（广州嘉美生物），异氟烷（深圳瑞沃德），EDTA（北京拜尔迪生物），苏木素溶液、伊红溶液（北京索莱宝），胎牛血清（美国Hyclone），4%多聚甲醛固定液（武汉博士德）。小动物活体成像仪（美国Molecular Devices），倒置显微镜（日本Olympus）。

1.2 细胞培养 将MDA-MB-231-luc 和4T1-luc 细胞置于37 ℃水浴箱中快速震荡融化，800 r/min离心3 min，分别加入含10% 胎牛血清的DMEM、RPMI1640 培养液，37 ℃、5% CO2孵箱中培养，待细胞贴壁生长至80% 左右即可传代。PBS 漂洗，0.25%胰蛋白酶消化，待细胞回缩、胞体变圆即终止消化，800 r/min 离心3 min，按1∶3 进行传代。根据前期研究及参考文献，调整MDA-MB-231-luc细胞密度为5 × 107/mL、4T1-luc 细胞密度为5 × 106/mL，置于冰上备用。

1.3 骨转移模型建立 将BALC/c 裸小鼠随机分为左心室注射组、胫骨注射组、尾动脉注射组，每组各8 只，分别给予MDA-MB-231-luc 细胞左心室注射、胫骨骨髓腔注射、尾动脉注射；将BALB/C 小鼠随机分为胫骨注射组、尾动脉注射组（由于4T1-luc细胞左心室内注射易发生内脏多发转移［2］，模型可靠性较低，故未设置左心室注射组），每组各8 只，分别给予4T1-luc 细胞胫骨骨髓腔注射、尾动脉注射。左心室注射方法：小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，固定，从胸部左侧第二肋间旁开2～3 mm进针，深度5～6 mm，略回抽，见压力较高的血液呈喷射状进入注射器针筒，表明针尖已进入左心室，于30～60 s内缓慢注射肿瘤细胞悬液0.1 mL。胫骨骨髓腔注射方法：小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，固定，屈曲肢膝关节呈90°，确定胫骨平台部位，用29 G 胰岛素注射器针头从胫骨近端向胫骨远端斜下穿刺，缓慢左右旋转进针直至骨髓腔，针尖有明显的落空感并部位固定，难以左右晃动，使用微量注射器依次吸入1 μL 明胶海绵水溶液、10 μL 肿瘤细胞悬液，缓慢注射。尾动脉注射方法：将小鼠置于固定器内，露出尾部并用温水浸泡，使尾部血管充盈，向尾动脉推注肿瘤细胞悬液0.1 mL。

1.4 乳腺癌转移灶观察 MDA-MB-231-luc 细胞造模组于第10、20 天，4T1-luc 细胞造模组于第10 天进行活体成像。使用异氟烷进行气体麻醉，成像前5 min 予腹腔注射荧光素酶底物D，使用小动物活体成像系统观察全身肿瘤细胞荧光强度，荧光信号越强、颜色越亮，表明肿瘤细胞浓度越高，以此评估转移灶的进展情况。

1.5 骨组织病理学观察 MDA-MB-231-luc 细胞模型组于造模后第20天、4T1-luc细胞模型组于造模后第10 天颈椎脱臼法处死，取腭骨、左右肩胛骨、胸骨、椎骨、左右肱骨、左右股骨，剥离干净肌肉、筋膜等组织，4%多聚甲醛固定24 h，EDTA 脱钙，裸小鼠和普通小鼠脱钙时间分别约为3 周和5 周。脱钙结束后组织脱水、包埋、蜡块切片，切片厚度为0.4μm。取骨组织切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，苏木素染色，显微镜下观察细胞核呈蓝色；随后置于伊红染液中染色30 s，梯度乙醇脱水，二甲苯透明、封片，显微镜观察病灶肿瘤细胞生长、骨质破坏情况。

2 结果

2.1 各组小鼠一般状态观察结果 造模后24 h内，MDA-MB-231-luc 细胞左心室注射组1 只裸小鼠死亡，解剖发现小鼠死亡原因为心脏破裂出血；其他小鼠均存活。MDA-MB-231-luc 细胞各组肉眼未见明显瘤体生长，小鼠精神状态良好、活动正常，进食正常。4T1-luc细胞胫骨注射组造模后第10天，肉眼可见骨转移瘤；尾动脉注射组呈弓背样状态，触摸小鼠尾背部有明显僵硬感，小鼠逐渐行动迟缓，精神萎靡、嗜睡，皮毛无光泽，食物和水纳入减少。

2.2 各组小鼠乳腺癌转移情况 MDA-MB-231-luc细胞造模后第10 天，左心室注射组3 只小鼠心脏周围显现蓝、绿色荧光，表明肿瘤细胞有漏出，造模失败，其余4只小鼠心脏周围无明显显像，造模后第20天显示荧光信号散在分布于全身；胫骨注射组显示双侧胫骨荧光信号；尾动脉注射组显示双侧肺部荧光信号（OSID码图1）。4T1-luc细胞造模后第10天，尾动脉注射组显示双侧股骨及尾背部荧光信号，胫骨注射组显示双侧胫骨荧光信号，两组荧光信号均较强（OSID码图2）。

2.3 各组小鼠骨组织病理变化 MDA-MB-231-luc细胞造模后第20天，胫骨注射组骨质破坏明显、肿瘤细胞呈团状生长，细胞结构、形态异常；尾动脉注射组形成肺转移病灶，未见明显骨转移病灶；左心室注射组可见少量肿瘤细胞浸入于骨组织、骨质破坏较少（OSID 码图3）。4T1-luc细胞造模后第10天，胫骨注射组可见胫骨近端浸润大量乳腺癌细胞，并呈外向型生长，形态异常、细胞排列紧密，肿瘤灶内见少量片状骨组织；尾动脉注射组可见尾背部转移灶，肿瘤细胞包绕骨组织生长，侵蚀、破坏骨质（OSID码图4）。

2.4 各组乳腺癌骨转移模型造模成功率 MDAMB-231-luc 细胞造模后第20 天，左心室注射组4 只发生骨转移，造模成功率为57%；尾动脉注射组未见骨转移病灶；胫骨注射组均形成骨转移模型，造模成功率为100%。4T1-luc 细胞造模后第10 天，尾动脉注射组、胫骨注射组造模成功率均为100%，其中尾动脉注射组2例伴有肺转移病灶。

3 讨论

乳腺癌易发生转移，其转移方式包括血行播散、淋巴转移、直接蔓延等，肿瘤细胞从原发灶脱落进入转移阶段，经历定植和存活、休眠、再活化、增殖与侵袭四个阶段［3-4］。乳腺癌具有明显的骨转移倾向，多通过血行播散引起，但其复杂的转移机制尚未完全明确，需要通过骨转移动物模型深入开展相关研究。乳腺癌骨转移动物模型是研究乳腺癌发病、侵袭和转移过程以及评估药物有效性不可缺少的实验工具，因此，合格的乳腺癌骨转移动物模型应能够较好的模拟转移发生和发展过程［2］。

乳腺癌骨转移动物模型可采用多种方式构建，主要有原位移植法、局部注射法和血流播散法，如自发性骨转移模型（原位注射法）、骨定植模型（骨内注射）以及血管注射模型（左心室注射、动脉注射）［5-6］。本研究采用左心室注射、胫骨骨髓腔注射以及尾动脉注射构建乳腺癌骨转移小鼠模型，比较三种造模方式的小鼠存活率、骨转移成功率的差异。

左心室注射法广泛应用于建立小鼠骨转移模型，该方法将肿瘤细胞注射到左心室，通过动脉血流传播到包括骨髓组织在内的整个身体，最终发展成骨和其他器官的转移性病灶，该模型概括了骨转移过程，如循环系统中肿瘤细胞存活、外渗、微集落形成和完整骨髓转移进展［7-8］，但对操作技术要求高，小鼠易发生心脏损伤出血、肿瘤细胞渗漏入心包、血容量急剧增加伴随循环衰竭等问题［9］。崔永奇等［10］采用左心室注射法将SPC-A-1、XL-2 细胞接种于BLAB/c 裸小鼠建立骨转移模型，模型组小鼠出现消瘦、脊柱弯曲等症状，经Micro CT 和HE 染色明确骨转移率在40%～60%。本研究利用MDA-MB-231-luc细胞进行左心室注射造模，发现左心室注射法能够较好模拟乳腺癌骨转移的早期病理过程，但造模成功率仅有57%，部分小鼠发生心脏损伤死亡，且易出现肿瘤细胞渗漏于心包，形成局部心包转移，并且造模后20 天才能观察到荧光信号。张帆等［11］采用MDA-MB-231-luc 细胞进行裸小鼠左心室注射建立乳腺癌骨转移动物模型，骨转移发生率为48.15%。这表明该方式造模成功率较低，不利于大批量开展乳腺癌骨转移防治实验。

胫骨骨髓腔注射法将乳腺癌细胞直接接种于胫骨骨髓腔内，模拟肿瘤细胞定植于骨转移生态位后的状态，可用来研究肿瘤细胞和其他细胞（如成骨细胞、破骨细胞）相互调控、串扰的关系以及药物防治骨转移的有效性和安全性［12］，具有成瘤率高、方法简单易行等优势；其缺点是无法模拟肿瘤细胞从原发灶脱离后定植于骨的全过程，并且造成小鼠胫骨皮质、骨髓腔损伤［13］。本研究结果显示，胫骨骨髓腔注射法造模成功率为100%，局部肿瘤病灶生长迅速，HE 染色显示骨质破坏明显、肿瘤细胞呈团状生长，细胞结构、形态异常，表明该方式造模成功率高。

动脉注射方面，目前多采用髂内动脉注射、尾动脉注射建立骨转移模型。髂内动脉注射能够选择性地将乳腺癌细胞递送到小鼠后肢骨髓，形成干骺端骨转移模型，但其复杂的操作流程不适合大批量的小鼠实验，同时存在局部感染的风险［14］。KUCHIMARU 等［15］通过小鼠尾动脉注射法成功建立乳腺癌骨转移模型，采用小动物活体成像技术发现肿瘤细胞优先定植于小鼠后肢骨组织，而不是进入尾静脉血管，其操作过程简单易行。我们尝试采用尾动脉注射法进行造模，结果发现MDA-MB-231-luc细胞多聚集于裸鼠肺部并形成肺转移，未见形成骨转移病灶；而尾动脉注射4T1-luc 细胞建立模型方面，小动物活体成像以及HE 染色显示肿瘤细胞聚集于小鼠尾背部，形成局部骨转移，骨转移局部肿瘤生长迅速，表明不同细胞系尾动脉注射骨转移的发生率有明显差异。

综上所述，采用左心室注射、胫骨骨髓腔注射、尾动脉注射乳腺癌细胞构建乳腺癌骨转移模型，胫骨骨髓腔注射法具有造模成功率高的优势；左心室注射能够最大限度模拟骨转移发生、发展的自然过程，克服了胫骨骨髓腔注射法的不足，但对操作技术要求高且造模成功率相对较低；尾动脉注射作为建立骨转移动物模型的新策略，该方法的可行性和稳定性尚需进一步研究。实际应用中可根据三种造模方式的优缺点，选择最适宜的方式。