艾迪注射液对宫颈癌细胞的放疗增敏性作用观察

韩朵，石书玮，田菲，庞得全，张晋冀，聂秋明

1 华北理工大学附属医院放疗科，河北唐山 063000；2 华北理工大学附属医院肿瘤外科；3 华北理工大学附属医院中医科

宫颈癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤。近年来，宫颈癌的发病率呈上升趋势，且逐渐年轻化。统计数据显示，全世界每年约有57.0 万例宫颈癌新发病例，31.1 万例死亡病例［1］。放疗是目前治疗宫颈癌的主要方法之一，大部分宫颈癌患者经过放疗可有效控制病情，但仍有约30%的患者复发，其机制可能与肿瘤细胞对放疗抵抗有关［2］。明确放疗抵抗的原因，对放疗不敏感的宫颈癌患者进行个体化的综合治疗，有助于改善患者预后，提高其生存率。艾迪注射液是纯中药制剂，具有清热解毒、消瘀散结的作用，常用于肝癌、肺癌、直肠癌等恶性肿瘤的治疗。研究显示，肺癌、乳腺癌、食管癌患者放化疗期间联合应用艾迪注射液，不仅能够减轻放化疗相关的不良反应，还可提高临床疗效［3-4］。但艾迪注射液能否提高宫颈癌细胞的放疗敏感性目前尚不明确。2019 年4 月—2020 年6 月，我们观察了艾迪注射液对宫颈癌SiHa 细胞放疗敏感性的影响，并探讨其作用机制，为深入研究艾迪注射液的抗肿瘤作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 宫颈癌SiHa 细胞购于美国标准生物品收藏中心。艾迪注射液（贵州益佰制药股份有限公司）；MEM 培养基、胎牛血清、EDTA（美国Gibco 公司）；PBS（中国Solarbio 公司）；Annexin Ⅴ-PI 凋亡检测试剂盒、TRIzol 试剂盒（美国Invitrogen 公司）；反转录试剂盒、SYBR Green 荧光定量PCR 试剂盒（长沙艾科瑞生物科技有限公司）；DEPC 水（上海江莱生物科技有限公司）。CO2恒温细胞培养箱（美国Thermo 公司）；显微镜（日本Olympus 公司）；台式高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；医用直线加速器（美国瓦里安公司）；流式细胞仪（FACS Culibur，美国BD Biosciences公司）；紫外分光光度计（美国GE 公司）；荧光定量PCR 仪（德国Eppendoff公司）。

1.2 细胞培养 取SiHa 细胞，加入含10%胎牛血清、青霉素—链霉素双抗溶液的MEM 培养基，置于37 ℃含5% CO2的恒温细胞培养箱中培养。常规更换培养液，待细胞融合度达到70%～80%时，加入胰酶消化传代。取对数生长期细胞用于实验。

1.3 细胞放疗敏感性观察 采用细胞克隆形成实验。取对数生长期细胞，按3 × 105/孔接种于6 孔板中。将细胞分为空白对照组和艾迪注射液组，空白对照组加入100 μL 培养液，艾迪注射液组加入10 mg/mL艾迪注射液100 μL，置于细胞培养箱中培养24 h。使用医用直线加速器对细胞进行放疗，分别给予0、2、4、6、8 Gy 照射剂量，放疗结束后将细胞继续培养15 h，然后加入胰酶消化，制成单细胞悬液。将细胞悬液稀释，接受0、2、4、6、8 Gy 照射剂量的细胞分别接种200、500、1 500、6 000、8 000 个至6 孔板中，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度环境下培养10～13 d，观察培养皿中出现肉眼可见的克隆时停止培养。PBS 清洗，加入结晶紫固定液将细胞固定15 min，流水冲洗，空气中干燥，在低倍镜显微镜下计数大于50 个细胞的克隆数。计算两组0 Gy 时的克隆形成率（PE），PE=0 Gy 时克隆数/接种细胞数×100%；然后根据PE 计算两组2、4、6、8 Gy 时的存活分数（SF），SF=2、4、6、8 Gy 时克隆数/（接种细胞数×PE） × 100%。SF降低表示放疗敏感性升高。

1.4 细胞凋亡检测 采用AnnexinⅤ/PI 双染法。取对数生长期细胞，按照2 × 106/孔接种于6 孔板中，将细胞分成空白对照组、放疗组、艾迪注射液+放疗组。空白对照组加入100 μL 培养液；放疗组加入100 μL 培养液培养24 h 后，使用直线加速器进行放疗，照射剂量10 Gy；艾迪注射液+放疗组加入10 mg/mL 艾迪注射液100 μL 培养24 h 后，用直线加速器进行放疗，照射剂量10 Gy。放疗后48 h 消化、洗涤并重悬细胞，加入稀释的PI 和AnnexinⅤ染液混匀，室温避光孵育15 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.5 细胞凋亡蛋白Bcl-2 mRNA 检测 采用实时定量PCR 法。按照1 × 105个细胞接种于6 孔板中，按照“1.4”中的分组和干预方法进行处理。取三组细胞，加入TRIzol 试剂提取细胞总RNA，用紫外分光光度计检测RNA 浓度。将RNA 反转录成cDNA，-20 ℃保存。使用荧光定量PCR仪（Eppendoff公司）进行检测。反应体系（10.0 μL）：SYBR Green 荧光染料预混试剂5.0 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA模板1.0 μL，Rnasefree 水3.6 μL。Bcl-2 引物序列：上游 5'-TGGATGACCGAGTACCTGAA-3' ，下 游5'-CAGCCAGGAGAAATCAAACA-3'。反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸60 s，共40 个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.6 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。数据均来自3 次独立重复实验，符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用配对样本t检验或独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞放疗敏感性比较 空白对照组和艾迪注射液组在照射剂量0 Gy 时的PE 分别为83.50% ± 7.00%、79.17% ± 4.16%。空白对照组在2、4、6、8 Gy 时的SF 为64.70% ± 6.42%、24.44% ±4.49%、4.42% ± 0.73%、0.36% ± 0.10%，艾迪注射液组分别为42.94% ± 3.01%、8.49% ± 1.23%、0.68% ± 0.11%、0.08% ± 0.03%；艾迪注射液组2、4、6、8 Gy 时的SF 较空白对照组降低（P=0.002），表明放疗敏感性升高。

2.2 各组细胞凋亡情况比较 空白对照组、放疗组、艾迪+放疗组细胞凋亡率分别为9.60% ±0.58%、23.14% ± 1.29%、28.33% ± 1.42%。放疗组细胞凋亡率高于空白对照组，艾迪+放疗组高于放疗组（P均＜0.01）。

2.3 各组细胞Bcl-2 mRNA 表达水平比较 空白对照组、放疗组、艾迪+放疗组Bcl-2 mRNA的相对表达量分别为2.80 ± 0.05、1.71 ± 0.02、1.45 ± 0.05。放疗组Bcl-2 mRNA 表达水平低于空白对照组，艾迪+放疗组低于放疗组（P均＜0.01）。

3 讨论

近年来，肿瘤的多学科综合治疗获得广泛认可和推广，放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗在宫颈癌治疗中发挥重要作用，同时传统药物与现代治疗的结合也为宫颈癌的治疗带来新的突破。艾迪注射液属于中药制剂，其主要成分为人参、黄芪、刺五加及斑蝥提取物。人参具有补脾益肺、生津安神的功效，其主要活性成分为人参皂苷。LEE 等［5］报道，人参皂苷Rh2 联合放疗可使结肠癌CT26/luc 细胞发生G2/M 期捕获，从而起到放疗增敏作用。黄芪具有益气、扶正、健脾的功效，能够增强机体免疫力。研究表明，黄芪能够通过下调Cyclin B、Cyclin E 表达及上调p21表达，抑制白血病K562细胞增殖［6］；通过下调Bcl-2 表达、上调Bax 表达，促进乳腺癌MCF-7 细胞凋亡［7］。刺五加具有平补肝肾、益精壮骨的功效，斑蝥具有破血消瘀、攻毒蚀疮的功效。从刺五加中提取的刺五加多糖和斑蝥中提取的班蝥素均可抑制非小细胞肺癌细胞增殖和转移［8-9］。此外，斑蝥素还可通过促进染色质致密性提高结肠癌细胞的放疗敏感性［10］。艾迪注射液是治疗妇科肿瘤的辅助用药，与单纯手术或放化疗相比，加入艾迪注射液可显著提高宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌等妇科恶性肿瘤患者的总生存率和生活质量［11］。此外，艾迪注射液还可以降低放化疗和靶向治疗导致的胃肠道反应、骨髓抑制、肝肾功能异常等不良反应，提高患者的体力状态KPS评分［12-15］。

放疗抵抗可导致肿瘤复发，放疗后细胞增殖、周期、凋亡的变化会影响细胞的放疗敏感性。近年来，研究者们不断寻找放疗抵抗的原因，并发掘提高放疗敏感性的方法及药物。XU等［16］研究发现，对脑胶质瘤SHG44 细胞给予艾迪注射液联合放疗后，细胞被更多地阻滞在G2/M期；艾迪注射液能够下调细胞周期蛋白B1 和上调Wee1 蛋白表达，起到放疗增敏作用。另有研究显示，艾迪注射液单用及联合放疗均可抑制Lewis 肺癌裸鼠移植瘤生长，且艾迪注射液具有一定的放射增敏作用，其机制可能与调节HIF-1α、p53、Survivin蛋白表达有关［27］。本研究采用克隆形成实验观察宫颈癌细胞的放疗敏感性，结果显示，与空白对照组相比，艾迪注射液组宫颈癌细胞的放疗敏感性明显升高，表明艾迪注射液对宫颈癌细胞有放疗增敏作用。

细胞凋亡是一种复杂而精细的程序性细胞死亡过程，在免疫、生物体进化和内环境稳定维持等方面发挥重要作用。研究显示，艾迪注射液可通过调节PI3K/AKT 和MAPK 信号转导途径，诱导MMP 裂解激活线粒体凋亡途径，抑制肝癌细胞生长，促进其凋亡［18］。本研究结果显示，与放疗组比较，艾迪+放疗组细胞凋亡率明显升高，表明艾迪注射液能够有效诱导宫颈癌Siha细胞放疗后的凋亡。

Bcl-2基因存在于线粒体外膜、内质网膜和核膜上，是一种癌基因，具有明显抑制细胞凋亡的作用。Bcl-2 基因的编码产物Bcl-2 蛋白是细胞内完整的膜蛋白，在促进细胞生长方面发挥关键作用。研究显示，Bcl-2 基因可通过启动Bcl-2 家族以及Caspase 家族相关凋亡因子的释放而调控细胞凋亡过程［19］。本研究结果显示，与放疗组比较，艾迪+放疗组细胞Bcl-2 mRNA 表达明显降低，表明艾迪注射液可下调Bcl-2 mRNA表达，从而通过促进宫颈癌SiHa细胞凋亡来提高其放疗敏感性。

综上所述，艾迪注射液可增强SiHa 细胞的放疗敏感性，其机制可能与下调Bcl-2基因的表达从而促进SiHa细胞放疗后的凋亡有关。