五谷虫中蛆激酶分离及其生物活性评价

刘 灿，刘秋荻，张凯欣，马彤瑶，汪文漪，马兰青*

（1.北京农学院农业农村部华北都市农业重点实验室，北京 102206； 2.北京农学院生物与资源环境学院，北京 102206）

血栓栓塞型疾病对心、脑、肺中血管系统造成损害，严重危害人体健康。自然界是获取溶栓药物的天然宝库，研究报道微生物、动植物中均可分离得到具有溶栓活性的物质，如利用溶血性链球菌制备链激酶［1］，从人尿液中提取尿激酶［2］，枯草芽孢杆菌中分离纳豆激酶［3］，利用赤子爱胜蚓制备蚓激酶［4］，以江浙蝮蛇蛇毒为原料获取蛇毒溶栓酶［5］，从海洋生物单环刺螠中提取单环刺螠溶栓酶［6］，以沙蚕、黄粉虫为原料制备沙蚕溶栓酶［7］和黄粉虫溶栓酶［8］。

五谷虫又名蝇蛆，《本草纲目》 记载其可“治小儿诸疳积、疳疮，热病谵妄，毒痢作吐”［9］，用于创面感染、臁疮等疾病的治疗［10-12］。蝇蛆中凝集素具有抗菌、抗病毒的作用［13］； 抗菌肽可抑制金黄色葡萄球菌的繁殖［14］，预防呼吸道感染［15］； 溶菌酶可促进巨噬细胞的吞噬能力，增强机体免疫［16］； 脂肪酸具有抗肿瘤、抗HIV-1 整合酶活性［17］。基于前期筛选结果，本研究拟从五谷虫中分离蛆激酶并评价其活性，以期为该昆虫纤溶酶的理论研究和临床应用提供参考。

1 材料

1.1 仪器 ChemiDocTM XRS＋型凝胶成像仪（美国伯乐公司）； 艾本德5430 R 型低温高速离心机（德国艾本德公司）； DYY-4C 型电泳仪（北京市六一仪器厂）； 赛默飞3111 型二氧化碳恒温培养箱（美国赛默飞公司）； SHA-CA型水浴锅（常州荣华仪器制造公司）； LC-20A 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）； FA2004B 型电子天平（上海越平科学仪器制造有限公司）； THZ-C 型恒温振荡器（苏州培英实验设备有限公司）； JP-Blupadstart 型蛋白纯化系统（上海嘉鹏科技有限公司）。

1.2 试剂与药物 家蝇（合肥大元生物科技有限公司），通过对原料的COⅠ基因克隆、测序比对进行物种鉴定，鉴定结果为家蝇MuscadomesticaL.。CM52 型离子交换树脂（批号C8691）、苯甲脒Sepharose 4FF （批号S9400） （北京索莱宝科技有限公司）； 纤维蛋白原（编号140607，18 个酪蛋白单位/瓶）、凝血酶（编号140605）、纤维蛋白溶酶原（纤溶酶，编号140606）、蚓激酶标准品（编号140650，24 000 U/支） （中国食品药品检定研究院）；N-α-苯甲酰-DL-精氨酰-4-硝基苯胺盐酸盐（BAPNA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号B100879，纯度＞98%）； 苯甲基磺酰氟（PMSF，编号A100754）、抑肽酶（编号A100429）［生工生物工程（上海） 有限公司］。

2 方法

2.1 蛆激酶提取、分离与纯化

2.1.1 盐析法提取粗酶 取新鲜冷冻家蝇幼虫100 g，用水洗净，加入1 800 mL 蒸馏水匀浆，8 500 r/min 离心10 min 以除去杂质，收集上清液，加入硫酸铵使其饱和度达到30%，在4 ℃下静置2 h，待蛋白沉淀析出后8 500 r/min离心，收集上清液，再补充硫酸铵至饱和度为70%，静置，8 500 r/min 离心，弃上清液，收集沉淀，用纯净水溶解，透析袋除去溶解液中盐离子至电导率为50 μs/cm，即得粗提液。

2.1.2 CM52 离子交换层析 采用阳离子交换树脂CM52，平衡液PBS 缓冲液（pH ＝8，10 mmol/L）； 洗脱液含0.5 mol/L 的NaCl-PBS 缓冲液（pH ＝8，10 mmol/L）； 体积流量1 mL/min，收集有活性的洗脱峰溶液并进行透析，除去溶液中盐离子。

2.1.3 苯甲脒Sepharose 4FF 亲和层析 采用填料苯甲脒琼脂糖凝胶进行亲和层析； 柱床体积10 mL； 平衡液PBS缓冲液 （pH ＝7.5，100 mmol/L）； 甘氨酸盐酸缓冲液（pH＝3.0，50 mmol/L） 洗脱，体积流量0.5 mL/min，收集活性洗脱峰并进行透析至电导率＜10 μs/cm，冷冻干燥。

2.2 蛆激酶溶纤活性测定 参照《国家食品药品监督管理局国家药典委员会审定国家药品标准WS1- （X-052） -2001Z》，精密量取不同浓度蚓激酶标准品及样品溶液适量，点在纤维蛋白平皿上，加盖，置于37 ℃恒温箱中反应18 h，取出，通过卡尺测量溶纤圈垂直两直径，以蚓激酶单位数的对数为横坐标（X），垂直两直径乘积的对数为纵坐标（Y） 进行回归，将溶纤圈垂直两直径乘积的对数代入其中，计算效价单位数。

2.3 蛆激酶对纤溶酶原的激活作用 纤维蛋白溶酶原加入1.8 mL 水溶解，制成10 酪蛋白单位/mL 的溶液。取1.5 mL 离心管，加入蛆激酶20 μL （比活性5 600 U/mL），再加入纤溶酶原溶液制成含0.1 酪蛋白单位/管的供试品溶液，作为实验组，同时选择生理盐水作为对照组，按“2.2” 项下方法测定溶纤活性，以对照组相对酶活性100%计算实验组相对酶活。

2.4 蛆激酶蛋白分子量测定 采用SDS-PAGE 电泳，胶配方为12%分离胶、5% 浓缩胶，电泳条件为电压调至80 V保持恒压，待溴酚蓝指示剂移动进浓缩胶时电压调至120 V 并保持恒压，以考马斯亮蓝R-250 进行染色，放入脱色液中［冰醋酸-无水乙醇-水（3 ∶10 ∶27） ］，置于摇床上，设定转速为55 r/min，待条带清晰可见后倒掉脱色液，拍照。

2.5 蛆激酶对纤维蛋白原（牛血） 的降解作用 取1.5 mL 离心管，加入80 μL 1.5 mg /mL 纤维蛋白原、8 μL 蛆激酶（活性37 000 U/mL），混匀，37 ℃水浴反应（转速110 r/min） 1、3、10、30 min 及1、1.5、24 h 时取出离心管，置于-20 ℃冰箱中终止反应，加入含变性剂的蛋白质Loading Buffer，沸水浴加热5 min，以纤维蛋白原为对照，采用SDS-PAGE 电泳分析蛆激酶对纤维蛋白原各亚基的降解情况。

2.6 蛆激酶作用靶点分析 离心管加入3 mL 底物BAPNA、5 μL 蛆激酶（比活性约13 000 U/mL），混匀，在37 ℃下保温，于0.5、1、3、5、24 h 各取20 μL，乙腈稀释4 倍后0.22 μm 微孔滤膜过滤，采用HPLC 法分析不同时间BAPNA 底物的降解情况，条件为Zorbax SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）； 流动相水（A） -乙腈（B），梯度洗脱（0 ～10 min，20% ～100% B； 11 ～15 min，100%B； 16～20 min，100% ～20%B）； 体积流量0.8 mL/min； 柱温25 ℃； 检测波长253 nm； 进样量20 μL。

2.7 蛆激酶酶动力学参数测定 以BAPNA 为底物，配制0.05、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.5、2 mmol/L溶液。将3 mL 不同浓度底物溶液、5 μL 蛆激酶（活性14 000 U/mL） 在37 ℃下反应，于410 nm 波长处测定在2 min 内的光密度（OD） 变化，计算酶活性，以每1 min 生成1 mmoL/L 底物所需酶量定义为水解BAPNA 酶活性单位（1 U），采用米氏方程进行计算［18］，公式为V＝Vmax×［S］ /Km＋［S］，再通过双倒数法将其转化成线性方程式（Lineweaver-Burk 方程式）［19］，公式为1/V＝Km/Vmax×1/［S］ ＋1/Vmax，其中V为酶促反应速率，Km为米氏常数，［S］ 为底物浓度，Vmax为最大反应速率。

2.8 抑制剂对蛆激酶活性的影响 采用丝氨酸蛋白酶专一性抑制剂判定蛆激酶活性中心类型，将PMSF 溶于异丙醇中，质量浓度为5.23 mg/mL （30 mmol/L），使用前加水稀释（由于其在水溶液中易分解，故现用现配），同时抑肽酶用蒸馏水进行溶解（现用现配）。取1.5 mL 离心管，加入蛆激酶（活性4 000 U/mL） 20 μL，再加入PMSF、抑肽酶，使离心管中抑制剂终浓度为1、5 mmol/L，以蒸馏水为对照，按“2.2” 项下方法测定，以对照组相对酶活性100%计算实验组相对酶活。

3 结果

3.1 蛆激酶提取、分离与纯化 盐析后，粗酶比活性为959.84 U/mg （n＝3），经羧甲基纤维素CM-52 弱阳离子交换层析分离后升至17 858 U/mg （n＝3），苯甲脒琼脂糖凝胶4FF 纯化后进一步升至933 262 U/mg （n＝3）。由图1 可知，原料中富含蛋白质，经硫酸铵分级沉淀除去部分无活性的蛋白，再经CM-52 除去大量杂质，最后经亲和层析获得蛆激酶，分子量约为25 kDa。

图1 蛆激酶纯化过程中的SDS-PAGE 电泳

3.2 蛆激酶对激活纤溶酶原的激活作用 由图2 可知，蛆激酶、纤溶酶原混合物中纤维蛋白平板上的溶纤圈直径大于蛆激酶，表明前者溶纤活性高于后者，这是因为纤溶酶原自身无溶解纤维蛋白的能力，而蛆激酶具有激活纤溶酶原的作用，可降解平板中纤维蛋白凝块，使得溶纤圈更大。

3.3 蛆激酶降解纤维蛋白原（牛血） 情况 由图3 可知，蛆激酶能有效水解纤维蛋白原的α-亚基、β-亚基、γ-亚基［20］，降解次序依次为α 亚基、β 亚基和γ 亚基，即对α亚基的水解作用最快，反应1 min 后即大部分被快速降解，3 min 后被完全降解； 反应10 min 后β 亚基被水解，1 h 内完全降解； γ 亚基在1.5 h 内无明显水解，24 h 后才被完全降解。

图3 蛆激酶对纤维蛋白原的降解情况

3.4 蛆激酶酶切位点 如图4A 所示，BAPNA 保留时间为13.3 min，对硝基苯胺保留时间为8.6 min，苯甲酰精氨酸保留时间为2.1 min； 如图4B 所示，在保留时间2.1、8.6 min 处出现色谱峰，与对硝基苯胺、苯甲酰精氨酸一致，提示BAPNA 已被蛆激酶降解，产生了苯甲酰精氨酸、对硝基苯胺。继续酶解后，随着反应时间延长苯甲酰精氨酸、对硝基苯胺信号值明显升高，BAPNA 响应值逐渐降低，表明其不断被降解，生成了苯甲酰精氨酸、对硝基苯胺，提示激酶具有降解Arg-X 酰胺键（精氨酸酰胺键，“X” 代表其他氨基酸残基） 的能力，过程见图5。

图4 蛆激酶对底物BAPNA 降解的HPLC 色谱图

图5 蛆激酶降解N-α-苯甲酰-DL-精氨酰-4-硝基苯胺盐酸盐（BAPNA） 的过程

3.5 蛆激酶酶动力学研究 由图6A 可知，底物浓度在0.05 ～0.1 mmoL/L 之间时，为一级反应； 在0.1 ～1.5 mmoL/L 之间时，酶促反应速度逐渐加快，为混合级反应；进一步提高底物浓度时，反应速度达到最大值，为零级反应。蛆激酶的酶促反应速度和底物浓度之间的关系符合米氏酶特征，Lineweaver-Burk 方程曲线见图6B，为1/V＝12.42× （1/ ［S］ ） ＋40.96 （R2＝0.998 0），Vmax＝0.024 4 U，Km＝0.303 mmoL/L，催化常数 （转化数）Kcat＝1.627 1/s，Kcat/Km＝5.369 L/ （s·mmoL）。

图6 蛆激酶酶动力学研究结果

3.6 抑制剂对酶活性的影响 由表1 可知，PMSF、抑肽酶对酶活有强烈的抑制作用，在1 mmol/L PMSF 作用下蛆激酶残余酶活为24.60%； 1 mmol/L 抑肽酶可完全抑制蛆激酶活性。由于PMSF、抑肽酶为丝氨酸蛋白酶专一性抑制剂［21］，对蛆激酶有抑制作用，故推测蛆激酶可能属于丝氨酸蛋白酶家族。

表1 丝氨酸蛋白酶抑制剂对蛆激酶活性的影响（±s，n＝3）

表1 丝氨酸蛋白酶抑制剂对蛆激酶活性的影响（±s，n＝3）

注： 与对照组比较，*P ＜0.05； 与1 mmol/L PMSF 组比较，＃P＜0.05。

组别浓度/（mmol·L-1）溶纤活性/%对照组—100 PMSF 组124.60±0.35*PMSF 组516.98±0.49*＃抑肽酶组10*抑肽酶组50*

4 讨论与结论

五谷虫在含有大量腐败物质、病原微生物的环境中生长，可能存在各种用于代谢有毒物质、抵御致病微生物的酶类，目前已报道抗菌肽、蝇蛆凝集素、尿囊素、溶菌酶、酚氧化酶等活性产物。本实验利用盐析、离子交换层析、亲和层析首次对五谷虫中纤溶酶进行分离纯化，制备高活性蛆激酶，该类酶大多为丝氨酸蛋白酶家族，其活性能被丝氨酸特异性抑制剂苯甲基磺酰氟及抑肽酶所抑制，表明其亦为丝氨酸蛋白酶家族。

为了理清蛆激酶作用途径，本实验考察其对纤维蛋白平板的溶纤效果，发现其能将纤维蛋白平板分解，具有溶纤活性。机体纤溶系统与凝血系统维持血液系统平衡，当平衡被病理过程破坏时，过量凝血酶被激活，将纤维蛋白原转化成不溶性纤维蛋白，纤维蛋白沉积形成血栓骨架，与血小板、血细胞共同构成血栓，导致血液凝固［22］，引发体内血栓形成，因此，直接降解纤维蛋白是溶栓药物发挥溶栓效果的重要途径，也是蛆激酶的重要活性特征。

纤维蛋白原水平变化在临床诊断中发挥重要作用，研究表明，冠心病等患有心血管疾病人群体内的纤维蛋白原水平升高［23］，故在临床上降低血浆中其水平可有效预防血栓形成［24］。本实验以纤维蛋白原为底物，发现蛆激酶可依次降解纤维蛋白原的中α、β、γ 亚基，提示它具有预防血栓形成的潜力。

组织型纤溶酶原激活剂及尿激酶作为传统溶栓药物，可将纤溶酶原激活为纤溶酶，从而发挥溶栓活性，本实验发现，蛆激酶也显示出激活纤溶酶原的特点，能将纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶，并且还能将BAPNA 进行降解，提示蛋白中Arg-X 酰胺键可能为蛆激酶作用靶点。

综上所述，五谷虫作为纤溶酶提取的原料，具有价格低廉、来源广泛的优势，本实验开展了蛆激酶制备和评价工作，发现其具有降解纤维蛋白、分解纤维蛋白原、激活纤溶酶原的功能，可为开发多靶点、高效、廉价溶栓药物及治疗高纤维蛋白原血症药物提供一定参考。