基于熵权法和灰色关联度法评价枸杞子质量

余钟莲，王 瑞，杨 莉，王峥涛，石燕红，4*

（1.上海中医药大学中药学院，上海 201203； 2.上海中医药大学交叉科学研究院，上海 201203； 3.上海中医药大学中药研究所，中药标准化教育部重点实验室，上海 201203； 4.上海中医药大学中医药国际标准化研究所，上海 201203）

枸杞子为茄科植物宁夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果实，具有滋补肝肾、益精明目的功效［1］。其化学成分包括多糖、生物碱、酚酸、类胡萝卜素等，具有调节免疫、抗肿瘤、抗衰老、降血糖血脂、保护神经等作用［2］。枸杞子广泛种植于宁夏、新疆、甘肃、西藏等地，但自然环境和种植条件的差异导致不同产地的枸杞子质量参差不齐［3］。此外，枸杞子育化品系繁多，宁杞系列是主要的栽培品种，但不同品系间的质量差异未见系统的比较研究［4-5］。目前枸杞子的质量评价多基于甜菜碱等2020 年版《中国药典》 规定的含测成分，检测指标过于单一，无法全面表征枸杞子的质量属性［6-7］。课题组前期对枸杞子中的葫芦巴碱、枸杞酸和玉米黄素双棕榈酸酯（ZD） 进行分析方法和生物活性的研究，结果均表明其含量较为丰富，在抗氧化和保护肝肾等方面药效显著［8-13］。近年来，灰色关联度法结合熵权法的综合评价模式已经广泛应用于白芷、人参、羌活等中药材的质量研究中，熵权法对指标权重进行客观赋值，灰色关联度法根据关联度进行质量排序，能更为客观全面的评价中药材质量［14-16］。

本研究以小分子类成分甜菜碱、葫芦巴碱、枸杞酸和ZD 的含量为指标，结合灰色关联度法和熵权法建立枸杞子多指标综合评价模型，对不同产地和不同品系的枸杞子进行综合质量比较，以期为该药材品质评价和质量标准提升提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）； ACQUITY UPC2超高效合相色谱（美国Waters 公司）； HWS-24 恒温水浴锅（上海城献仪器设备有限公司）；Milli-Q Advantage 型超纯水系统 （美国Millipore 公司）；BT25S 型电子分析天平（德国赛多利斯公司）； KQ-250DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂 甜菜碱（CAS 107-43-7，纯度≥98%）、葫芦巴碱（CAS 535-83-1，纯度≥98%）、枸杞酸（CAS 562043-82-7，纯度≥98%） 对照品均购于上海诗丹德标准技术服务有限公司； 玉米黄素双棕榈酸酯对照品（ZD，CAS 144-67-2，纯度≥95%） 购于美国Sigma 公司。高纯度CO2（纯度≥99.999%） 购于上海氯闵气体有限公司。甲醇、乙腈均为色谱纯，购于美国Thermo 公司； 甲醇、乙醇、乙酸铵均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司； 水为超纯水。

1.3 药材 枸杞子共58 批，具体见表1，经上海中医药大学中药研究所吴立宏研究员和石燕红副研究员共同鉴定为茄科植物宁夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果实，凭证标本保存于上海中药标准化研究中心。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取甜菜碱、葫芦巴碱对照品适量，甲醇制成分别含两者2、0.2 mg/mL 的溶液； 精密称取ZD、枸杞酸对照品适量，分别加入0.1% BHT 乙酸乙酯溶液、甲醇制成质量浓度均为1 mg/mL 的溶液，即得。

2.2 供试品溶液制备

2.2.1 甜菜碱、葫芦巴碱 参考文献［17］ 报道，精密称取1.0 g 研碎的枸杞子，加25 mL 二氯甲烷加热回流提取30 min，过滤，残渣加25 mL 80%乙醇（pH＝1.0），加热回流提取30 min，过滤，滤液浓缩至2 mL。另取玻璃层析柱（直径1～2 cm，长度20 ～30 cm），称取30 g 碱性氧化铝（甲醇浸泡过夜），湿法装柱至8 ～10 cm，加入10 mL 0.1 mol/L 盐酸平衡，吸取2 mL 滤液上样（控制体积流量为1 滴/s），80 mL 5%氨水甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至近干膏状，甲醇定容至10 mL，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2.2 枸杞酸 参考文献［18］ 报道，精密称取0.5 g 研碎的枸杞子，置于具塞锥形瓶中，加入25 mL 蒸馏水，称定质量，超声（250 W、40 kHz、20 ℃） 处理40 min，放冷至室温，蒸馏水补足减失的质量，摇匀，过滤，取上清液1 mL，甲醇定容至5 mL，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 ZD 氯化胆碱与丙二酸按1 ∶1 比例混合，在80 ℃下磁力搅拌至澄清均匀无色液体，作为低共熔试剂（DES）。参考文献［19］ 报道，精密称取1.0 g 研碎的枸杞子，加入2.0 g DES 溶液、30 mL 甲醇、10 mL 正己烷，超声（250 W、40 kHz、20 ℃） 处理4 h，离心后将上清液与10 mL 水-正己烷（6 ∶4） 混合萃取，静置后分层，收集正己烷层，下层液体用正己烷多次萃取至完全，合并上层萃取液，回收正己烷，加入含0.1% BHT 的乙酸乙酯定容至10 mL，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得，置于闭口塞棕色液相瓶中备用。

2.3 色谱条件

2.3.1 甜菜碱、葫芦巴碱含量测定（HPLC） 菲罗门Titank HILIC 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相乙腈-水（81 ∶19）； 体积流量0.7 mL/min； 柱温40 ℃； 检测波长195 nm； 进样量10 μL。色谱图见图1。

2.3.2 枸杞酸含量测定（HPLC） YMC Triart-Diol-Hilic色谱柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相乙腈-66.7 mmol/L 乙酸铵（85 ∶15）； 体积流量0.7 mL/min； 柱温40 ℃； 检测波长260 nm； 进样量10 μL。色谱图见图1。

2.3.3 ZD 含量测定 （UPC2） Acquity HSS C18色谱柱（150 mm×3.0 mm，1.8 μm）； 流动相CO2（A） -甲醇（B），梯度洗脱（0～8 min，20% ～50%B； 8～11 min，50%B）； 背压1 500 psi （1 psi ＝6.895 kPa）； 体积流量0.8 mL/min； 柱温35 ℃； 检测波长450 nm； 进样量2 μL。色谱图见图1。

2.4 方法学考察 4 种成分线性关系见表2； 精密度、重复性、稳定性试验中各成分RSD 均小于3.0%，表明仪器精密度、方法重复性、溶液72 h 内稳定性良好； 甜菜碱、葫芦巴碱、枸杞酸、ZD 平均加样回收率分别为98.04%、97.65%、92.40%、99.15%，RSD 分别为2.15%、2.88%、1.96%、1.15%。

表2 各成分线性关系

2.5 含量测定 表3 显示，宁夏产药材中各成分含量最高，以舟塔、石嘴山产较优，宁杞7 号整体质量高于宁杞1 号。

表3 各成分含量测定结果（%，±s，n＝3）

表3 各成分含量测定结果（%，±s，n＝3）

编号甜菜碱葫芦巴碱枸杞酸ZD Goji-10.892±0.0340.046±0.0030.995±0.0140.255±0.005 Goji-20.980±0.0330.049±0.0011.192±0.0050.260±0.010 Goji-30.820±0.0210.039±0.0031.401±0.0020.176±0.001 Goji-40.792±0.0120.034±0.0010.900±0.0010.261±0.001 Goji-50.982±0.0030.037±0.0011.369±0.0100.215±0.005 Goji-60.851±0.0260.031±0.0031.238±0.0040.197±0.008 Goji-70.844±0.0350.034±0.0021.053±0.0150.280±0.016 Goji-81.014±0.0040.048±0.0011.471±0.0210.260±0.002 Goji-91.131±0.0280.044±0.0070.972±0.0220.214±0.001 Goji-101.174±0.0040.073±0.0011.552±0.0150.393±0.007 Goji-111.208±0.0040.079±0.0011.257±0.0130.329±0.033 Goji-120.862±0.0050.058±0.0011.316±0.0090.168±0.001 Goji-130.899±0.0020.064±0.0011.544±0.0040.212±0.003 Goji-140.789±0.0020.058±0.0011.329±0.0210.340±0.005 Goji-150.840±0.0030.063±0.0011.305±0.0100.336±0.016 Goji-160.959±0.0010.057±0.0011.185±0.0040.124±0.004 Goji-170.762±0.0150.051±0.0021.084±0.0160.161±0.004 Goji-180.851±0.0140.047±0.0021.133±0.0150.147±0.007 Goji-190.805±0.0110.021±0.0011.109±0.0130.314±0.012 Goji-200.731±0.0170.022±0.0011.483±0.0080.181±0.007 Goji-210.770±0.0190.023±0.0011.065±0.0040.152±0.012 Goji-220.828±0.0100.043±0.0011.553±0.0090.142±0.004 Goji-230.931±0.0060.045±0.0031.450±0.0010.180±0.004 Goji-240.890±0.0110.048±0.0011.254±0.0170.170±0.003 Goji-250.868±0.0050.031±0.0011.155±0.0070.344±0.009 Goji-260.795±0.0080.027±0.0010.916±0.0140.422±0.003 Goji-270.733±0.0010.022±0.0040.887±0.0130.234±0.003 Goji-280.780±0.0080.025±0.0011.459±0.0020.461±0.015 Goji-290.827±0.0030.024±0.0010.877±0.0050.202±0.008 Goji-300.963±0.0010.036±0.0010.932±0.0130.360±0.010 Goji-311.174±0.0040.042±0.0011.094±0.0110.230±0.014 Goji-320.845±0.0040.044±0.0011.469±0.0020.271±0.005 Goji-330.806±0.0010.028±0.0011.247±0.0120.161±0.010 Goji-341.019±0.0100.039±0.0010.924±0.0080.218±0.008 Goji-351.058±0.0010.036±0.0010.958±0.0100.525±0.017 Goji-360.712±0.0110.041±0.0011.512±0.0010.153±0.002 Goji-370.738±0.0150.043±0.0020.936±0.0140.195±0.001 Goji-380.843±0.0030.052±0.0011.459±0.0030.092±0.001 Goji-390.713±0.0050.040±0.0031.150±0.0170.123±0.002 Goji-400.882±0.0010.046±0.0011.104±0.0130.139±0.002 Goji-410.715±0.0010.035±0.0011.008±0.0170.265±0.001 Goji-420.844±0.0220.025±0.0010.992±0.0080.230±0.003 Goji-430.839±0.0030.030±0.0030.965±0.0050.125±0.001 Goji-440.755±0.0380.037±0.0011.180±0.0070.122±0.002 Goji-451.002±0.0340.035±0.0021.121±0.0190.098±0.001 Goji-460.819±0.0350.045±0.0021.329±0.0040.184±0.002 Goji-470.801±0.0010.050±0.0040.940±0.0050.097±0.001 Goji-480.984±0.0050.043±0.0021.114±0.0060.256±0.006 Goji-491.013±0.0120.043±0.0010.750±0.0080.268±0.008 Goji-500.796±0.0670.044±0.0011.072±0.0030.191±0.004 Goji-510.967±0.0610.043±0.0011.030±0.0100.190±0.004 Goji-520.732±0.0190.033±0.0010.918±0.0140.196±0.008 Goji-530.830±0.0140.023±0.0021.052±0.0080.356±0.048 Goji-540.956±0.0080.026±0.0011.004±0.0140.199±0.012 Goji-550.740±0.0220.029±0.0031.257±0.0040.168±0.006 Goji-560.743±0.0120.035±0.0011.255±0.0050.392±0.001 Goji-570.982±0.0190.033±0.0011.022±0.0040.298±0.007 Goji-580.909±0.0050.036±0.0011.128±0.0120.175±0.002

2.6 质量评价

2.6.1 熵权法

2.6.1.1 原始数据规格化处理 设有m个样品，每个样品有n项评价指标，由此组成单元序列｛Xij｝ （i＝1，2，3，……，m；j＝1，2，3，……，n，本研究中m为58，n为4）。按照公式Yij＝ ［Xij-min （Xi） ］ / ［max （Xi） -min（Xi） ］ 进行处理。

表4 熵权法所得信息熵及权重

2.6.2 灰色关联度法

2.6.2.1 参考序列 设有m个样品，每个样品有n项评价指标，由此组成单元序列｛Xij｝ （i＝1，2，3，……，m；j＝1，2，3，……，n，本研究中m为58，n为4）。同时，设最优参考序列为｛Xsj｝ （j＝1，2，3，……，n），最差参考序列为｛Xtj｝ （j＝1，2，3，……，n），其中最优、最差参考序列中各项内容分别为各评价指标的最大值、最小值。

2.6.2.2 原始数据规格化处理 由于各评价指标之间数据差异较大，故按照公式Yij＝Xij/Xj进行处理，其中Yij为规格化处理后的数据，Xij为原始数据，Xj为第j个指标的平均值。

2.6.2.3 关联系数 评价指标相对于最优、最差参考序列的关联系数分别按照公式计算（i＝ 1，2，3，……，m；j＝ 1，2，3，……，n），ρ为分辨系数，计算各指标权重Wj，结果见表5。

表5 评价指标相对于最优、最差参考序列的关联系数

2.6.2.4 关联度及相对关联度 相对于最优参考序列的关联度ri（s）和最差参考序列的关联度ri（t）分别按照公式计算。最佳评价单元定义为相对于最优参考序列的关联度ri（s）最大，相对于最差参考序列的关联度ri（t）最小者，故将评价单元序列同时相对于最优、最差参考序列的相对关联度ri作为评价指标，ri越大，药材质量越好，再按照公式ri＝ri（s）/［ri（s）＋ri（t）］ 计算相对关联度，结果见表6～7。

表6 不同批次枸杞子关联度及排序

3 讨论

目前对枸杞子的质量研究大多集中于枸杞多糖，忽视了其他小分子成分在枸杞子质量评价中的重要性。因此，本实验综合考虑枸杞子的水溶性与脂溶性成分，除2020 年版《中国药典》 规定的甜菜碱外，还增加了葫芦巴碱、枸杞酸和ZD 进行枸杞子药材质量的综合评价研究。

熵权法结果显示甜菜碱的权重最大，表明其对枸杞子的质量评价影响最大，之后依次为葫芦巴碱、ZD 和枸杞酸。枸杞子的相对关联度范围为0.247 ～0.770，表明不同批次的枸杞子在质量上存在一定的差异。表7 结果显示，宁杞1 号的平均相对关联度均小于相应产地的宁杞7 号，宁杞7 号的质量相对优于宁杞1 号； 对于宁杞1 号和宁杞7号，宁夏产区枸杞子的平均相对关联度均高于其他产地，以上结果说明宁夏作为宁夏枸杞的道地产区，枸杞子的药材质量相对于其他产地更佳，其中以舟塔地区最优。宁杞4号（Goji-8） 和科杞608 （Goji-35） 的质量评价虽然较高，但由于样本量较少，后续需要更多样品进行验证。

4 结论

本研究对不同产地和品系58 批枸杞子中的4 种活性成分进行含量测定，采用熵权法对各指标客观赋权后以相对关联度为测度比较不同批次枸杞子药材的质量优劣，质量评价结果与传统枸杞子的道地产区及目前药材市场主流品种相符合，这说明通过测定枸杞子中甜菜碱、葫芦巴碱、枸杞酸和ZD 的含量并基于熵权法和灰色关联度法建立多指标综合评价模型可以较好地反映枸杞子的质量，为枸杞子药材质量评价标准研究提供参考。