不同采收成熟度对烤烟萜类致香化合物及烟叶品质的影响

宋笑龙 刘芳 宗胜杰 马浩波 孟智勇 张国平 王宏

摘要： 为探究不同采收成熟度对烤烟萜类致香物质代谢特征的影响，为烤烟适时采收及提高烟叶香气品质提供理论依据，对各成熟度烤烟鲜烟叶腺毛分泌物（二萜类化合物）、类胡萝卜素（四萜类化合物）含量与烤后烟叶常规化学成分、香气成分进行测定，并对萜类物质合成和降解途径关键基因表达量进行检测；对烟叶外观质量、感官评吸指标进行评价。结果显示，随着采收成熟度的提高，烟叶表面腺毛密度、类胡萝卜素及其降解产物含量呈降低趋势；鲜烟叶西柏三烯二醇含量整体呈现先降低后升高的趋势，而其降解产物含量呈上升趋势。西柏烷类合成基因  CYC-1  和  CYP71D16  的表达量随着烤烟采收成熟度的提高呈先增加后降低的趋势，DXR表达量在中部叶中呈降低趋势，而在上部叶中差异很小。类胡萝卜素降解途径的关键基因PAL、LOX和合成途径的关键基因PSY在中部葉中呈上调趋势，而在下部叶中呈下调趋势。在成熟和完熟时采收，烤后烟叶的颜色、油分、嗅香等指标得分更高，香气量、浓度更足，外观质量和评吸质量更佳。综合来看，中部叶在成熟时采收，上部叶在完熟时采收，烟叶的整体表现更好。

关键词： 烤烟；采收成熟度；西柏烷二萜；类胡萝卜素；香气成分

中图分类号：TS41+1  文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）02-0104-08

烟草香气质量是评价烟叶内在品质的核心内容和重要指标之一，然而随着降焦工艺的发展，烟气中香气成分含量也随之降低，香气不足成为影响烟叶工业可用性的问题之一［1］。香气物质组成和代谢十分复杂，因此很难通过农艺措施来改善烟叶的香气品质［2］。研究发现，对烟草香气生成量贡献最大的3类致香前体物质分别为多酚类化合物、萜烯类化合物及生物碱［3］。烤烟萜烯类致香前体物主要有类胡萝卜素（四萜类化合物）、西柏烷二萜和赖百当类（二萜类化合物），其中赖百当类化合物是香料烟叶中独有的，多数烤烟品种不含该成分［4-5］。西柏烷二萜主要存在于鲜烟叶中，主要成分是西柏三烯一醇（CBT-ol）和西柏三烯二醇（CBT-diol），对烤后烟叶的吃味具有重要贡献，同时由于其气味的特殊性，可作为防御害虫的壁垒［6-7］；调制后的西柏烷二萜主要降解为茄酮及其衍生物，是烤后烟叶香气的重要来源之一［8-10］。类胡萝卜素属于四萜类化合物，其降解产物二氢猕猴桃内酯、大马酮、紫罗兰酮、巨豆三烯酮等是烤烟中性致香物质的重要组成成分，并且香味物质刺激性较小、香气质量较好，使烟叶能够产生木香、花香、果香和甜香等特色香气［11-13］。研究发现，采收成熟度对烤烟香气质量有显著影响，不同成熟度烟叶萜类化合物及代谢酶活性差异较大，不同基因型烤烟叶面腺毛形态特征和分泌特性也存在差异［14-16］。

烤烟品种Y2001是中烟100经甲基磺酸乙酯（EMS）诱变，定向选育的高分泌改良品系，与中烟100相比，农艺性状更优良，腺毛密度高，蔗糖酯、西柏烷二萜化合物等叶面分泌物显著提高［17］。目前对烤烟不同成熟度腺毛分泌特性及萜类致香物质合成相关酶基因表达方面的研究尚缺乏，本研究以烤烟品系Y2001为研究对象，探讨不同采收成熟度对鲜烟叶西柏烷和类胡萝卜素含量及其降解产物的影响，分析相关合成和降解基因表达量，进而对不同采收成熟度的烤烟品质进行综合判定，以期为精准把握烟叶采收最佳成熟度，做到最大程度发挥烤烟烟叶特性、提高烟叶综合品质和工业可用性提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2022年在河南省农业科学院烟草研究所试验地（34°07′06″N，113°83′09″E）进行，供试烤烟品种为Y2001，按常规措施进行栽培管理。以烤烟上部叶和中部叶为分析材料，根据黄树永等对烟叶从成熟度的划分，将成熟度分为欠熟、成熟、完熟和过熟4个等级［18］，详见表1。

1.2 测定项目和方法

1.2.1 鲜烟叶腺毛观测 不同成熟度各选取5株烟株，分别取约10 cm中上部鲜烟叶，用0.2%（质量体积比）罗丹明B水溶液染色15 min，用清水去除未结合的罗丹明B并自然晾干，沿着叶片中部主脉两侧1 cm处剪取约1.0 cm×0.3 cm大小的叶片组织，置于超景深显微镜下对叶面腺毛形态进行观察并统计。

1.2.2 烤后烟叶常规化学成分的测定 烟叶烘烤结束后，分别依照YC/T 159—2002《烟草及烟草制品 水溶性糖的测定 连续流动法》对总糖和还原糖含量、YC/T 161—2002《烟草及烟草制品 总氮的测定 连续流动法》对总氮含量、YC/T 162—2002《烟草及烟草制品 氯的测定 连续流动法》对氯含量、YC/T 173—2003《烟草及烟草制品 钾的测定 火焰光度法》对钾含量、YC/T 166—2003《烟草及烟草制品 总蛋白质含量的测定》对蛋白质含量、YC/T 468—2013《烟草及烟草制品 总植物碱的测定 连续流动（硫氰酸钾）》对烟碱含量、YC/T 216—2007《烟草及烟草制品 淀粉的测定 连续流动法》对淀粉含量进行检测。

1.2.3 类胡萝卜素含量的测定 （1）称取剪碎的新鲜样品0.1 g左右，放入研钵中，加液氮研磨充分后加95%乙醇溶液，研成均浆，继续研磨至组织变白。（2）滤纸用乙醇湿润后置漏斗中，将研磨液过滤到25 mL棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研杵及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。（3）用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入漏斗中。直至滤纸和残渣中无绿色。最后用95%乙醇溶液定容至25 mL，摇匀。（4）把提取液倒入光径1 cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在665、649、470 nm波长下测定吸光度，并根据如下公式计算叶绿素a（Ca）、叶绿素b（Cb）及类胡萝卜素（Cx）含量（μg/g）：

Ca=13.95D665 nm-6.88D649 nm；

Cb=24.96D649 nm-7.32D665 nm；

Cx=（1 000D470 nm-2.05Ca-114.8Cb）/245。

1.2.4 西柏烷类和烤后烟叶香气物质含量的测定 取约2.0 g样品，利用蒸馏萃取装置，通过水蒸气蒸馏-乙腈萃取法提取有机相，利用气相色谱-质谱联用法（GC-MS）进行定性定量分析。

1.2.5 烤后烟叶外观和感官评吸质量评价 烤后烟叶出炕后回潮、平衡水分，依据烟草行业标准GB 2635—1992《烤烟》对各处理烟叶成熟度、油分、颜色、身份、结构、色度、含青度、挂灰和杂色等外观质量指标进行评价，各指标权重分别按照0.3、0.1、0.2、0.1、0.1、0.1、0.05、0.025、0.025赋值，计算烤烟外观综合得分。按照9分制对香气质、香气量、浓度、杂气、劲头、刺激性、余味、燃烧性、灰色等感官评吸指标进行打分，各指标权重依次赋值为0.25、0.15、0.1、0.12、0.1、0.13、0.1、0.025、0.025。

1.2.6 基因表达分析 在中、上部叶不同成熟期，各选取长势基本一致的烟株5株，取同一部位长 10 cm 左右的叶片，用锡箔纸包裹后置于液氮中速冻，保存于-80  ℃超低温冰箱中备用。用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒提取叶片总RNA；之后用One Step Prime Script RT-PCR Kit成品试剂盒进行qRT-PCR分析。根据GenBank发布的烟草西柏烷生物合成关键基因DXR（5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶）、  CYC-1  （西柏三烯一醇合成酶基因）和  CYP71D16  （西柏三烯二醇合成酶基因），类胡萝卜素合成基因：PSY（八氢番茄红素合成酶）、PDS（八氢番茄红素脱氢酶），胡萝卜素降解途径关键基因：PAL（苯丙氨酸解氨酶）、LOX（脂肪氧化酶），以  L25  作为内参基因［19］，设计各基因扩增引物（表2），具体按照试剂盒说明书进行。荧光定量PCR反应程序：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，按照2-ΔΔCT对结果进行分析，用Excel软件分析作图。

2 结果与分析

2.1 不同采收成熟度对烤烟腺毛密度的影响

如图1、图2所示，考烟上部叶腺毛分布与中部叶相似，不同成熟度烤烟鲜烟叶腺毛密度分布表现均为正面少于背面。随着成熟度的增加，烤烟叶片颜色由绿色逐渐变为黄色，海绵组织逐渐变薄，叶片厚度变薄，长柄腺毛和短柄腺毛不同程度脱落，均以过熟叶腺毛密度最低。

2.2 不同采收成熟度对鲜烟叶萜类化合物的影响

由表3可知，随着采收成熟度提高，各叶位鲜烟叶西柏三烯二醇含量整体呈现先降低后升高的趋势，而类胡萝卜素呈逐渐降低的趋势，以欠熟烟叶类胡萝卜素含量最高。上部叶中α-西柏三烯二醇以过熟叶中含量最高，β-西柏三烯二醇以完熟叶中含量最高，总西柏三烯二醇含量以过熟烟叶中含量最高；中部叶中α-西柏三烯二醇和总西柏三烯二醇含量均以完熟叶最高，β-西柏三烯二醇含量在过熟叶中最高。

2.3 不同采收成熟度烤烟鲜烟叶萜类相关基因表达

不同采收成熟度烤烟烟叶致香物质合成和降解途径相关基因表达量如图3、图4所示，DXR、  CYP71D16 和CYC-1  共同参与调控西柏烷类化合物的合成，烤烟中部叶  CYC-1和CYP71D16  基因表达量随着采收成熟度的提高呈先增加后降低的趋势，分别在完熟、成熟时达到最高峰；DXR表达量呈降低趋势。类胡萝卜素合成基因PSY和降解途径关键基因PAL、LOX表达量整体呈上调趋势，在过熟时表达量达到最大值，且显著高于其他处理；PDS 表达量呈降低趋势，其中成熟烟叶的表达量显著低于其他处理。

上部叶  CYC-1和CYP71D16  基因表达量的变化趋势与中部叶相似，呈现先上调后下调的趋势，均在成熟时期达到最大值，且显著高于其他处理；DXR表达量的变化不大，各处理差异不显著。PAL和LOX基因表达量整体呈下调趋势，与中部叶相反；PSY、PDS表达量在欠熟至成熟阶段表达量有所升高，在成熟阶段达到最大值，之后随着成熟度提高而显著降低。

2.4 不同采收成熟度对烤后烟叶常规化学成分的影响

由表4可知，采收成熟度显著影响烤后烟叶的内在化学成分。随着采收成熟度增加，上部叶烤后烟叶总糖、蛋白质、氯、淀粉含量和糖碱比整体呈降低趋势；总氮、钾含量呈先升高后降低的趋势，均以成熟期含量最高；欠熟采收则表现为上部叶总糖、蛋白质、淀粉含量偏高，完熟和过熟采收总氮含量偏低，导致氮碱比偏低；过熟采收时，烟叶钾含量偏低。中部叶烤后，烟叶总糖、蛋白质和淀粉含量呈降低趋势，氯含量差异较小；总氮、钾、蛋白质含量和氮碱比随着采收成熟度的增加而整体降低；烟碱含量整体低于上部叶，氮碱比偏低。上部叶、中部叶淀粉含量整体偏高，总氮含量偏低，适当推迟采收，有利于其含量降低，上部叶完熟采收、中部叶成熟采收时，烤后烟叶中的主要化学成分更协调。

2.5 不同采收成熟度对烤后烟叶外观质量的影响

由表5可知，不同采收成熟度对烟叶外观质量的影响较大。相比欠熟采收，成熟至过熟阶段采收，烟叶叶片结构疏松度更好；与欠熟采收相比，正常采收、推迟采收烤烟烟叶的成熟度得分更高，身份适中，油分更足，色度更好，含青减少。上部叶完熟和过熟时采收与欠熟、成熟时采收相比，挂灰杂色明显增加，烟叶整体得分排名为B3>B2>B4>B1，但成熟和完熟时采收，烤后烟叶外观得分差异不大。中部叶成熟和完熟采收时，烟叶各外观质量指标均优于欠熟和过熟时采收，得分排名為C2>C3>C4>C1。

2.6 不同采收成熟度对烤后烟叶香气含量的影响

由表6可知，不同采收成熟度烤烟香气物质及其前体物存在明显区别。随着采收时间的推迟，上部叶类胡萝卜素降解产物如巨豆三烯酮、大马酮、3-羟基-2-丁酮、香叶基丙酮等含量整体呈下降趋势，多数致香成分没有明显变化， 总体来看，上部叶类胡萝卜素降解产物总量整体呈现降低趋势；西柏烷类降解产物茄酮整体呈现上升趋势，丁内酯含量随着成熟度的增加有所降低，但变化幅度不大；上部叶香气物质含量排名为B4>B2>B3>B1。中部叶不同成熟度烟叶西柏烷类降解产物整体变化趋势与上部叶相似， 整体呈上升趋势，类胡萝卜素呈先上升后降低趋势。香气物质含量排名为C2>C3> C4>C1。不同叶位同一成熟度，烟叶致香成分含量存在差异，上部叶香气物质含量整体高于中部叶。

2.7 不同采收成熟度对烤后烟叶评吸质量的影响

由表7可知，随着采收成熟度的提高，中部叶、上部叶烤后烟叶香气质、香气量、浓度、余味、杂气、刺激性得分均呈先增加后降低的趋势；上部叶成熟烟叶在香气质、劲头和燃烧性方面得分最高；完熟和过熟叶在香气质方面欠佳。中部完熟烟叶在香气量、浓度、余味、杂气、刺激性和劲头方面的得分均为最高，过熟烟叶的香气质最好，而香气量不足。上部叶各处理综合得分排名均为B2>B3>B1>B4，中部叶各处理综合得分排名均为C3>C2>C4>C1。

3 讨论与结论

不同采收成熟度对烤烟香气物质及前体物会产生一定影响，准确把握烟叶采收成熟度对提高烤烟产质量及提升烤后烟叶工业可用性有重要意义。本试验结果显示，衰老会导致烟叶表皮腺毛脱落，随着采收成熟度的提高，鲜烟叶表面腺毛密度、类胡萝卜素含量呈现降低的趋势，上部叶西柏三烯二醇含量以过熟烟叶最高，而中部叶以完熟叶最高。曾祥难的研究显示，成熟叶类胡萝卜素降解产物含量高于过熟和欠熟烟叶［20］；赵铭钦等对烟叶成熟度与香气质量的研究显示，烤烟香气成分含量随成熟度的提高而增加，最大出現在过熟阶段［14］；宣晓泉等认为，香气成分总量随成熟度提高而持续增加，最大值出现在完熟阶段，之后含量缓慢下降［21］；文利超等研究认为，随着烟叶成熟衰老，类胡萝卜素合成减弱而降解增强，类萝卜素降解基因部分呈下调表达，部分呈上调表达，合成相关基因多数呈下调表达［22］，与本研究烤烟中部烟叶表现一致。但上部 叶与中部叶PAL、LOX和PSY基因表达量存在一定差异，可能是由于不同叶位采收成熟标准不同导致。

成熟度与烤后烟叶的外观质量、评吸质量及香气质量等方面密切相关［9，23-24］。适熟采收初烤烟叶产质量最高、内在化学成分最协调、感官评吸质量最好，低成熟度（欠熟）烟叶采烤的烤后烟叶化学成分不协调，评吸质量表现为香气质差、香气量不足，刺激性明显，青杂气略重。采收时西柏烷类致香前体物质含量高，并不能决定其对烤后烟叶香气贡献大［25］，因此本研究中西柏烷二萜前体物含量与烤后烟叶中西柏烷降解产物不是完全对应的关系。另外，烟叶香气成分除了萜烯类化合物，还有其他成分如苯丙氨酸降解产物、棕色化反应产物等，尤其是质体色素降解产物新植二烯，其成分含量所占比重较高［26-27］，由此看来，西柏烷和类胡萝卜素降解产物含量高的处理，感官评吸指标香气质量得分不一定最高。综合看来，中部叶成熟采收，上部叶完熟采收，烟叶外观质量和感官评吸更佳，化学成分更协调，烟叶整体表现更好。

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收 稿日期：2023-04-04

基金项目：河南省农业科学院自主创新项目（编号：2022ZC19）。

作者简介：宋笑龙（1993—），女，河南洛阳人，硕士，研究实习员，主要从事烟叶调制加工研究。E-mail：292212139@qq.com。

通信作者：王 宏，农艺师，主要从事烟叶生产和烟基建设工作。E-mail：275014264@qq.com。